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目的内毒素血症是一种由感染诱发的全身性炎症反应综合征,内毒素血症发生发展的过程可造成多器官损伤,其中肺脏是最容易受到损伤的器官之一。有研究表明,氧化应激损伤是内毒素引起的组织损伤及炎症反应中的一个重要环节,也可能是内毒素血症多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)的重要原因之一,而线粒体动力学变化与氧化应激损伤密切相关。线粒体是真核细胞中重要的细胞器,不仅能通过三羧酸循环酶系产生ATP为细胞提供能量,对细胞内离子通道的调节、氧化应激和细胞凋亡的调控也发挥关键作用。线粒体分裂蛋白-1(mitochondrial fission 1 protein,Fis1)和哺乳动物的动力相关蛋白-1(dynamin-related protein 1,Drp1)是重要的线粒体分裂蛋白分子。Fis1位于线粒体外膜,Drp1在哺乳动物细胞胞浆中受Fis1的招募转位至线粒体外膜,诱导线粒体分裂。研究表明,磷酸化的Drp1的GTPase活性增加,可以导致线粒体分裂和融合失衡,导致线粒体过度分裂,产生大量管状和片断化的线粒体聚集在细胞核周围,从而导致ATP产量下降,诱导细胞凋亡,然而通过小干扰RNA抑制Drp1表达则会抑制线粒体的分裂,使线粒体融合程度增加,网络化程度加强,说明Drp1是线粒体分裂的必需分子。正常细胞内线粒体融合和分裂的平衡可以维持细胞内能量平衡,从而维持机体各系统的正常功能;Fisl是个相对较小的线粒体外膜蛋白,均匀的分布在线粒体表面,当细胞受损时,Fisl的表达升高,促进线粒体碎片化,诱导线粒体分裂,从而导致细胞凋亡;然而通过小干扰RNA抑制Fis1表达的细胞中线粒体分裂受到抑制,线粒体网络化程度增加,线粒体融合程度增加,说明Fis1是调节线粒体分裂的限制因子。血红素氧合酶1(heme oxygnase-1,HO-1),也被称为热休克蛋白32,是体内血红素代谢的限速酶,可被降解为一氧化碳、胆绿素(会被进一步降解为胆红素)和二价铁,可保护细胞免受氧化损伤,是机体重要的内源性保护系统,参与多种疾病的病理过程,通过抑制血小板聚集、改善微循环、抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡等多重机制发挥组织器官保护作用。本课题组前期研究结果表明,HO-1与线粒体动力学变化密切相关,但具体机制尚不明确。p38分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)位于细胞胞浆内,可被磷酸化形成p-p38 MAPK,从而进一步激活下游转录因子,是生物信号引起核反应的重要通路,在细胞炎症、细胞周期、氧化应激及细胞凋亡的调控中起着至关重要的作用,并能够诱导细胞HO-1基因的表达。大量研究证实,p38MAPK在参与急性肺损伤的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等机制中发挥了重要的作用,成为各领域研究的热点,但有关p38MAPK介导HO-1表达与线粒体动力学变化的研究少见报道。本研究拟探讨p38MAPK信号通路介导HO-1表达对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻击大鼠肺泡巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的影响,为阐明p38MAPK信号通路抑制线粒体分裂的机制提供理论依据。方法将NR8383细胞株用含有1%青链双抗、10%新生小牛血清的培养基培养。用磷酸缓冲盐溶液轻轻吹打细胞团制成悬浮溶液,待细胞融合成单层后计数。将大鼠肺泡巨噬细胞以2×105/ml密度接种于96孔板,200μl/孔,置37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养,达到80%融合后采用随机数字表法将细胞分为8组:正常对照组(C组)、LPS组(L组)、HO-1释放剂hemin+LPS组(LH组)、p38MAPK抑制剂SB203580+LPS组(LS组)、SB203580+LPS+hemin组(LHS组)、hemin组(H组)、SB203580(S组)、hemin+SB203580组(HS组)。L组加入10μg/ml LPS;LH组先加入20m M hemin,30min后加入10μg/ml LPS;LS组加入10μM SB203580,1h后加入10μg/ml LPS;LHS组加入10μM SB203580,30min后加入20 m M hemin,30min后加入10μg/ml LPS;H组加入20m M hemin;S组加入10μM SB203580;HS组加入10μM SB203580,30min后加入20m M hemin。细胞孵育24h时,应用试剂盒测定线粒体白介素-10(Interleukin,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力,应用RT-PCR测定HO-1、线粒体相关分裂蛋白Drp1和Fis1的表达,应用Western blot检测HO-1、Drp1、Fis1、p38和p-p38的表达。结果与C组比较,L组IL-10表达水平降低,TNF-α表达水平升高,MDA含量增加,SOD活力降低,ATP表达水平降低,HO-1、p38表达水平升高,线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达升高(P均<0.05);与L组比较,LH组IL-10表达水平升高,TNF-α表达水平降低,MDA含量降低,SOD活力增加,ATP表达水平升高,HO-1、p38表达水平升高,线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达降低(P均<0.05);与LH组比较,LS组IL-10表达水平降低,TNF-α表达水平升高,MDA含量增加,SOD活力降低,ATP表达水平降低,HO-1、p38表达水平降低,线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达升高(P均<0.05);与LS组比较,LHS组IL-10表达水平升高,TNF-α表达水平降低,MDA含量降低,SOD活力增加,HO-1、p38表达水平升高,线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达水平降低(P均<0.05);H组、S组和HS组作为对照组,各检测指标表达无统计学意义(P均>0.05)。结论在脂多糖攻击大鼠肺泡巨噬细胞模型中,大鼠肺泡巨噬细胞在脂多糖攻击24小时时炎症反应加重,氧化应激指标MDA和SOD表达具有统计学意义,线粒体分裂程度加重;血红素氧合酶1表达增加可减轻肺泡巨噬细胞炎症反应和氧化应激水平,下调线粒体分裂蛋白表达,且血红素氧合酶1抑制LPS攻击大鼠肺泡巨噬细胞中线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达机制与p38MAPK信号通路可能有关。