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第—部分 脂多糖诱导小鼠肺成纤维细胞有氧酵解的生物信息学研究目的:明确脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对小鼠肺成纤维细胞有氧酵解的诱导作用并使用生物信息学探讨其相关机制。方法:将培养至4～7代的小鼠肺成纤维细胞接种于六孔培养板,密度1×104/ml。待细胞贴壁后,更换无血清培养基饥饿过夜,采用随机数字表法将其分为4组(n=3):空白对照组(Con 组),0.5 μg/ml LPS 组(LPS0.5 组),2 μg/ml LPS 组(LPS2 组),4μg/ml LPS组(LPS4组)。除Con组外,分别加入以上终浓度的LPS继续培养24小时,收集细胞培养上清液,ELISA法检测不同浓度LPS刺激小鼠肺成纤维细胞24小时后细胞培养上清液中有氧酵解代谢产物乳酸的表达水平;采用基因芯片技术比较LPS诱导组与空白对照组小鼠肺成纤维细胞基因表达水平,筛选获得两组间差异表达基因,并通过生物信息学分析方法将差异基因在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中统计分析,寻找与糖代谢相关显著富集的信号通路以明确LPS诱导小鼠肺成纤维细胞有氧酵解的相关机制。结果:与空白对照组相比,不同浓度LPS刺激小鼠肺成纤维细胞均可引起细胞培养上清液中有氧酵解代谢产物乳酸含量显著增加(P<0.01(LPS0.5组),P<0.05(LPS2组),P<0.005(LPS4组)),并随着LPS刺激浓度的升高而升高;基因芯片筛选出LPS诱导组与空白对照组差异表达的基因,KEGG通路富集分析获得4条与糖代谢密切相关的信号转导通路,分别为胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、JAK-STAT信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、脂肪酸代谢通路(Fatty acid metabolism)以及鞘糖脂生物合成通路-乳糖和新乳糖系列(Glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series pathway)。结论:LPS可促进肺成纤维细胞有氧酵解产物乳酸的形成,该过程与胰岛素信号通路、JAK-STAT信号通路、脂肪酸代谢通路以及鞘糖脂生物合成通路-乳糖和新乳糖系列活化有关,可能是脓毒症相关性肺纤维化发生的重要机制之一。第二部分MAPK10介导脂多糖诱导小鼠肺成纤维细胞有氧酵解的机制研究目的:观察LPS刺激小鼠肺成纤维细胞后丝裂原激活蛋白激酶10(mitogen-activated protein kinase 10,MAPK10)的表达变化,明确 MAPK10 编码的c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinase 3,JNK3)蛋白在LPS诱导的有氧酵解过程中的作用。方法:将培养至4～7代的小鼠肺成纤维细胞接种于六孔培养板,密度1×104/ml。待细胞贴壁后,更换无血清培养基饥饿过夜,采用随机数字表法将其分为4组:PBS对照组(Con 组),0.25μg/ml LPS 组(LPS0.25 组),0.5μg/ml LPS 组(LPS0.5组),1μg/ml LPS组(LPS1组)。经LPS或PBS分别处理6、12、24小时后,采用qPCR分别检测MAPK10基因表达水平的变化。使用不同浓度(分别为1μm、5μm、10μm)的JNK抑制剂SP600125预处理小鼠肺成纤维细胞,再予LPS或PBS培养24小时,使用Westemblot检测不同浓度SP600125对LPS刺激小鼠肺成纤维细胞24小时后p-JNK,JNK蛋白表达水平的影响,ELISA检测细胞培养上清液中乳酸的含量变化;同时,使用MAPK 10 siRNA转染小鼠肺成纤维细胞,采用随机数字表法将其分为4组:阴性对照组、LPS刺激组、siRNA组、LPS+siRNA组,细胞经LPS培养24小时后,使用Westemblot检测转染MAPK 10 siRNA对LPS刺激小鼠肺成纤维细胞24小时后p-JNK,JNK蛋白表达水平的影响,ELISA检测细胞培养上清液中乳酸的含量变化。结果:与空白对照组相比,不同浓度LPS刺激小鼠肺成纤维细胞6小时、12小时、24小时均可引起MAPK10表达的显著上调,差异均具有统计学意义(6小时,LPS0.25 组:P<0.01,LPSo.5 组:P<0.05,LPS1组;P<0.01;12 小时,LPS0.25 组:P<0.05,LPS0.5 组:P<0.01,LPS1组:P<0.05;24 小时,LPS0.25 组:P<0.01,LPS0.5 组:P<0.01,LPS1组:P<0.01)。Western blot结果显示:不同浓度的JNK抑制剂SP600125以及转染MAPK 10 siRNA均可抑制LPS引起的小鼠肺成纤维细胞JNK磷酸化,p-JNK/JNK比值显著下降(均为P<0.05)。ELISA结果显示:不同浓度的JNK抑制剂SP600125以及转染MAPK 10 siRNA都可抑制LPS引起的小鼠肺成纤维细胞乳酸生成(均为P<0.05)。结论:LPS能通过上调胰岛素信号通路中MAPK10基因的表达诱导肺成纤维细胞有氧酵解过程,下调MAPK10基因表达或直接抑制MAPK10编码的JNK3蛋白活性能抑制LPS诱导的肺成纤维细胞乳酸生成,这可能是脓毒症相关性肺纤维化发生的重要机制之一。