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目的:子宫内膜异位症(Endometriosis,简称内异症)是妇科常见病,发病率为15-20％,恶变率为0.7％～1％。事实上,内异症恶变的实际发生率可能更高,主要因为恶变后生长旺盛的肿瘤组织破坏了起源组织,以致找不到内异症的组织学依据。另外,由于病理取材的局限性(病理取材只有大体标本的2％或1％),漏诊了同时存在的内异症,而将继发恶变误诊为原发恶性肿瘤。近年来,随着内异症的发病率在不断增高,内异症恶变的病例数也在逐年增加,内异症恶变的预防、治疗等问题在妇科领域日益受到重视,内异症恶变已成为内异症研究的热点问题之一。
内异症及其恶变最多发生于卵巢,恶变的主要病理类型为卵巢子宫内膜样腺癌(55.1％)及卵巢透明细胞癌(21.0％)。原发卵巢癌是死亡率最高的妇科肿瘤,由内异症恶变而来的卵巢癌虽然相对分期早、分化程度高、患者年轻,然而内异症广泛粘连、浸润的病理特点使内异症恶变行无瘤术困难,手术分期医源性增加,五年生存率与原发卵巢癌相似。因此,研究内异症恶变发生机制,筛查内异症恶变的高危人群,指导内异症患者的医疗干预时机及方式,使内异症恶变得以预防是改善其预后的主要手段。
1925年,Sampson首次报道内异症恶变并提出了确诊的3个条件,即:(1)癌组织和异位内膜并存于同一病变；(2)二者具有组织学相关性；(3)排除其它原发肿瘤的存在。Scott在此基础上进一步补充诊断标准,即:镜下可见异位子宫内膜向恶性移行的组织学证据。目前,以上病理诊断标准已得到国际公认,而严格的诊断标准却导致内异症恶变漏诊多、大样本病例缺乏、基础研究严重滞后于临床需求。
基因启动子的甲基化是导致基因表达沉默的一种重要的表观遗传机制,它能够通过抑制基因表达而使DNA修复、细胞周期、细胞凋亡、细胞粘附和解毒等细胞通路失活进而导致细胞的无限增殖,最终导致肿瘤的发生。研究表明,基因的异常甲基化是某些肿瘤发生过程中的早期事件。另外,在多种肿瘤中,DNA异常甲基化模式具有肿瘤特异性,以基因异常甲基化作为生物标记,不仅可以用于对疾病进行早期诊断及预后评估,还可用于对高危人群的检测和筛查,因此,系统研究疾病相关的异常甲基化基因对疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。多项研究表明,基因的异常甲基化所导致的基因表达沉默与卵巢癌的发生密切相关。同时,Martini等研究提示内异症患者的异位内膜组织中hMLH1启动子区域异常甲基化所导致的该基因表达沉默能够促使内异症恶变为子宫内膜样腺癌,认为应用免疫组化法检测hMLH1的蛋白表达可以作为内异症恶变筛查和早期诊断的有效手段。以上研究初步提示了基因异常甲基化与内异症恶变的相关性,为我们从表观遗传学角度研究内异症恶变的发生机制奠定了基础。
目前受到研究途径及标本量的限制,与内异症恶变相关基因水平的研究报道较少且多局限于单一的非特异性基因。本研究将首次从全基因组范围筛查卵巢内异症恶变相关异常甲基化候选基因,并通过在组织中对筛选出的异常甲基化候选基因与内异症恶变的相关性进行初步验证,确定卵巢内异症恶变相关异常甲基化靶基因,为探索卵巢内异症恶变发生机制奠定基础,也为寻找卵巢内异症恶变预防、早期诊断和治疗的靶基因提供理论依据。
方法:
一、通过甲基化GpG岛扩增结合代表性差异分析技术(MethylatedCpG islands amplification coupled representationaldifference analysis,MCA-RDA)筛查卵巢内异症恶变相关异常甲基化候选基因
(一)收集卵巢内异症恶变病例恶变后癌组织及癌旁内异症的新鲜组织标本；
(二)通过甲基化CpG岛扩增(MCA)技术富集癌及癌旁异位内膜组织中发生甲基化的CpG岛片段；
(三)通过代表性差异分析(RDA)技术获得恶变癌组织相对癌旁内异症组织的差异甲基化片段；
(四)通过对上述获得的差异甲基化片段进行克隆、测序及相似性分析,获得卵巢内异症恶变相关异常甲基化候选基因。
二、通过检测各组织中候选基因的甲基化及蛋白表达情况,初步验证候选基因与卵巢内异症恶变的相关性
(一)获取卵巢内异症及恶变病例的石蜡包埋组织标本,显微切割获取恶变组癌组织、癌旁异位内膜组织及内异症组异位内膜组织；
(二)甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)技术或亚硫酸氢盐修饰后酶切(Combined Bisulfite RestrictionAnalysis,COBRA)技术检测候选基因(RASSF2,hMLH1及SPOCK2)在相应组织中的甲基化情况；
(三)免疫组织化学技术检测上述卵巢内异症恶变相关异常甲基化靶基因(SPOCK2,RASSF2及hMLH1)在各组织中的蛋白表达情况。
三.通过去甲基化药物干预候选基因甲基化的细胞系,进一步验证基因异常甲基化与其表达的相关性
(一)去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理RASSF2及SPOCK2异常甲基化的卵巢癌细胞系(SKOV3)及内膜癌细胞系(HEC-1)；
(二)实时荧光定量PCR技术检测5-Aza-CdR干预对细胞中卵巢内异症恶变相关基因RASSF2及SPOCK2的mRNA表达情况的影响,探讨RASSF2及SPOCK2基因异常甲基化与其mRNA表达的相关性结果一、MCA-RDA技术筛查卵巢内异症恶变相关异常甲基化候选基因经过三轮杂交后,挑取共96个含有MCA-RDA产物片段的阳性菌落,通过检测插入片段的长度,证明其中68个为阳性单克隆菌落,用于最后测序。经测序后共获得40个差异甲基化片段,根据CpG岛判定标准对此40个差异甲基化片段进行分析后发现,其中14个差异甲基化片段符合CpG岛的判定标准,而其中9个差异甲基化的CpG岛位于所在基因的启动子区域,所对应的9个基因即为卵巢内异症恶变相关候选基因。候选基因根据功能分为3类,分别包括:①凋亡相关基因(RUNX3,RASSF2),②代谢相关酶类基因(GSTZ1,CYP2A,GBGT1,NDUFS1)及③其他(SPOCK2,TRIM36,ADAM22)。
二、候选基因甲基化及蛋白表达情况与卵巢内异症恶变的相关性
(一)SPOCK2表观失活与卵巢内异症恶变的相关性恶变组25例卵巢癌组织中,13例发生了SPOCK2基因的甲基化,15例癌旁异位内膜中,1例发生了该基因的甲基化;内异症组22例异位内膜中,有1例发生了该基因的甲基化。恶变组中,癌组织SPOCK2甲基化发生率高于癌旁异位内膜组织(p＜0.05):而恶变组异位内膜中该基因的甲基化发生率与内异症组异位内膜无统计学差异(p＞0.05)。在恶变组中:癌组织中SPOCK2蛋白表达低于癌旁异位内膜组织(p＜0.05)；而异位内膜组织中该基因的蛋白表达情况,恶变组与内异症组无显著统计学差异(p＞0.05)。SPOCK2异常甲基化与该基因蛋白表达产物缺失具有相关性(p＜0.05)。
(二)RASSF2表观失活与卵巢内异症恶变的相关性恶变组25例卵巢癌组织中,14例发生的RASSF2基因的甲基化,15例癌旁异位内膜中,2例发生了该基因的甲基化；内异症组:22例异位内膜中,有2例发生了该基因的甲基化。恶变组中,癌组织中RASSF2甲基化发生率高于癌旁异位内膜(p＜0.05)；而恶变组异位内膜中该基因的甲基化发生率与内异症组异位内膜无统计学差异(p＞0.05)。在恶变组中:癌组织RASSF2蛋白表达低于癌旁异位内膜组织(p＜0.05)；在异位内膜组织中该基因的蛋白表达情况:恶变组与异位内膜组无显著统计学差异(p＞0.05)。RASSF2异常甲基化与该基因蛋白表达产物缺失具有相关性(p＜0.05)。
(三)hMLH1表观失活与卵巢内异症恶变的相关性恶变组25例卵巢癌组织中,有12例发生的hMLH1基因的甲基化,13例癌旁异位内膜中,8例发生了该基因的甲基化;内异症组:20例异位内膜中,有3例发生了该基因的甲基化。恶变组中的癌组织与异位内膜无差异(p＞0.05)；恶变组中异位内膜hMLH1甲基化发生率显著高于内异症组异位内膜(p＜0.05)。在恶变组中:癌组织蛋白表达与异位内膜组织无显著统计学差异(p＞0.05)；在异位内膜组织中该基因的蛋白表达,恶变组低于内异症组(p＜0.05)。hMLH1蛋白表达缺失与该基因的异常甲基化具有相关性(p＜0.05)。
三、去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对候选基因甲基化的细胞系mRNA表达的影响
(一)5-Aza-CdR对卵巢癌(SKOV3)及内膜癌细胞系(HEC-1)SPOCK2 mRNA表达的影响卵巢癌及内膜癌细胞系中,设对照组(未加药物干预组)SPOCK2 mRNA相对表达水平为1,实验组(药物干预组)SPOCK2 mRNA相对表达水平分别为2.56±0.68及2.56±0.68,各细胞系中实验组与对照组比较,实验组SPOCK2 mRNA表达均高于对照组,差异有显著统计学意义(p＜0.05),5-Aza-CdR能诱导卵巢癌及内膜癌细胞系中SPOCK2 mRNA表达。
(二)5-Aza-CdR对卵巢癌(SKOV3)及内膜癌细胞系(HEC-1)RASSF2 mRNA表达的影响。
卵巢癌及内膜癌细胞系中,设对照组(未加药物干预组)RASSF2 mRNA相对表达水平为1,实验组(药物干预组)RASSF2 mRNA相对表达水平分别为3.40±1.05及8.33±1.71,各细胞系中实验组与对照组比较,实验组RASSF2 mRNA表达均高于对照组,差异有显著统计学意义(p＜0.05),5-Aza-CdR能诱导卵巢癌及内膜癌细胞系中RASSF2 mRNA表达。
结论：
1、基因异常甲基化在卵巢内异症恶变中是一种常见的表观遗传学事件。卵巢内异症恶变癌组织相对癌旁异位内膜组织存在差异甲基化基因。RUNX3、RASSF2、GSTZ1、CYP2A、GBGT1、NDUFS1、SPOCK2、ADAM22及TRIM36基因的异常甲基化可能参与了卵巢内异症恶变过程,是卵巢内异症恶变相关的候选基因。
2、SPOCK2,RASSF2及hMLH1启动子区域的异常甲基化能够引起相应基因的蛋白表达缺失。SPOCK2及RASSF2基因的表观失活与卵巢内异症恶变相关,参与了异位内膜向卵巢癌的恶变过程,可能是内异症恶变过程的晚期事件。hMLH1的表观失活与卵巢内异症恶变的发生相关,增加了异位内膜恶变的易感性,可能是卵巢内异症恶变过程中的早期事件。
3、SPOCK2及RASSF2基因在卵巢癌及内膜癌细系中存在异常甲基化,而特异性去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷可以诱导细胞系中SPOCK2及RASSF2基因的mRNA表达,使药物干预后的细胞系中SPOCK2及RASSF2基因mRNA的表达水平升高,SPOCK2及RASSF2基因甲基化与其mRNA表达具有相关性。