番木瓜性别演化的机理研究和类木瓜蛋白酶家族的谱系特异性扩增

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番木瓜的性别由一对演化初期的性染色体决定,即雌性(XX),雄性(XY)和两性(XYh)。高质量的性别决定区域参考序列对于番木瓜性别相关研究提供重要的序列指导。番木瓜性染色体的一个演化特征为Y(h)Y(h)基因型致死,我们对其候选基因CpEMB506进行了分析和功能验证。在性染色体演化过程中,Y(Yh)染色体上基因的丢失导致了雌性和雄性两种性别间的剂量不平衡,而性别分化导致不同性别类型产生一系列性别偏好性表达基因。番木瓜中剂量补偿效应和性别偏好基因的研究有助于我们理解其性别的分化和演化过程。性别分化与生殖器官发育直接相关,因而生殖器官不同发育时期的转录组动态为揭示雄蕊发育的分子机理网络提供参考。主要研究结果如下:通过Pacbio测序对番木瓜性别决定区域X和HSY进行重新组装。获得的组装序列与以前的版本比较有很大提升,X上缺口(Gap)数量从121减少到27个,HSY上的Gap数量从107减少到13个。我们还填补了 HSY上最大的缺口的部分序列,且填补序列末端匹配到X的1.9 Mb区域,而X的前1.9 Mb序列为X和HSY共有的knob1区域,因此明确了性染色体上性别决定区域与常染色的左边界。此外,本研究还发现了大量的新的HSY和X特异性重复序列和5S rDNA等串联重复富集序列。在番木瓜性别决定区域发现了AtEMB506的同源基因CpEMB506。拟南芥中,AtEMB506是胚胎发育关键基因,其纯合突变体是致死的,杂合突变体会产生25%的败育胚。CpEMB506在Y(Yh)上为假基因,因此推测为YY基因型胚致死候选基因。定量PCR和原位杂交结果显示该基因在授粉后15~35天的胚中表达量最高,这与YY基因型胚致死的时间相吻合。番木瓜X染色体上的CpEMB506能够基本恢复拟南芥emb506杂合突变体表型。为了获得可存活的YY基因型,我们将CpEMB506转基因至番木瓜愈伤组织并获得了转基因阳性植株。为了解番木瓜中是否存在剂量补偿效应,我们利用无性染色体的番木瓜近缘种Vasconcellea monoica作为原始对照,比较了雄性与雌性叶片和花中的基因表达情况。结果发现,性别决定区域部分基因存在剂量互补效应。番木瓜HSY性别决定区域有两个倒位,对应两个不同的演化阶层区。我们发现在古老演化阶层区的Y等位基因的表达量中值低于年轻演化阶层区,说明Y等位基因的表达量随着染色体演化减少。为了解番木瓜中性别偏好基因的表达及演化,我们对雌性和雄性番木瓜叶片,花和不同时期的雌雄蕊表达谱进行比较分析。生殖器官的性别偏好表达基因的数量远远多于叶片中的数量。虽然在各个发育阶段雌雄蕊间的雄性偏好基因与雌性偏好基因的总数量基本相同,但是雄性极端偏好基因(10倍以上差异)的数量要多于雌性极端偏好基因的数量。此外,雄性极端性别偏好基因的Ks和Ka/Ks比值较高,说明了其演化速率要高于其他基因。雄蕊发育时期转录组的研究有利于理解雄蕊形态发育过程。一些雄蕊发育过程中的关键基因在番木瓜中的转录水平变化趋势与模式植物拟南芥基本相似,说明了这些基因在雄蕊发育过程中的保守性。此外,多种激素参与了雄蕊发育过程。利用WGCNA基因共表达网络分析,我们获得了一个与花粉显著性相关的基因簇,包括六个候选核心转录因子。花粉表达基因的丰度低于其他时期,其相关性基因主要参与花粉萌发和花粉管伸长。番木瓜是木瓜蛋白酶的天然来源,我们还对具有重要应用价值的木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)家族基因进行了演化分析。在番木瓜基因组中鉴定出33个PLCPs,并将其分为9个亚家族。我们发现不同物种通过串联复制产生了不同的PLCP亚家族的基因扩增。番木瓜在亚家族Ⅲ发生谱系特异性的扩增,该扩增由三次连续的串联复制产生。我们估算了这三次复制发生的时间大约在在48 MYA,34 MYA和16MYA,这与番木瓜地理迁移时间和大洋板块漂移时间重叠。大部分亚家族Ⅲ的PLCPs在番木瓜叶片和绿色果实中表达量比较高。
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