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目的：
1.通过观察呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮（BEAS-2b）细胞后12h、24h Notch1、Hes1、黏蛋白5ac（Muc5ac）mRNA、蛋白表达情况和白细胞介素25（IL-25）蛋白水平的变化，探讨Notch1/Hes1信号通路在RSV感染气道黏液高分泌中的调控作用。
2.观察姜黄素衍生物（B6）、Notch通路γ-分泌酶抑制剂（DAPT）及地塞米松（DXM）对RSV感染BEAS-2b细胞Notch1、Hes1、Muc5ac及IL-25表达水平的影响，探讨姜黄素衍生物对RSV感染气道黏液高分泌的抑制效应及机制。
3.为临床应用姜黄素衍生物治疗RSV感染引起的气道黏液高分泌提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新思路。
方法：
1.建立RSV感染的细胞模型，将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至90%左右时，传代于六孔板中，随机分成6组：A组（B6+RSV组）、B组（DAPT+B6+RSV组）、C组（DAPT+RSV组）、D组（DXM+RSV组）、E组（RSV组）和F组（细胞对照组）。A组在RSV感染造模0.5h前予B6（10μmol/L）预处理，B组在B6预处理前先以DAPT（20μmol/L）预处理1h。造模开始前1h，D组加入DXM（0.01mg/ml）。A-E组以100TCID50RSV感染吸附BEAS-2b细胞2h，再加维持液继续培养至12h、24h收获细胞及上清液进行检测。
2.观察各组上述两个时间点细胞病变效应（CPE）情况；采用CCK8法检测B6、DAPT、DXM、DMSO对BEAS-2b细胞的毒性作用和B6对RSV的病毒抑制率。3.利用实时荧光定量（RT-PCR）检测上述12h、24h两个时间点各组Notch1、Hes1、Muc5ac mRNA表达情况。Western Blot法检测Notch1、Hes1、Muc5ac蛋白水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中IL-25蛋白水平。
结果：
1.RSV滴度测定：
本实验中RSV的TCID50为10-4.8/50μl，病毒攻击量为100TCID50。即10-2.8/50μl。
2.B6、DAPT、DXM及0.1%DMSO的细胞毒性：
10μmol/L B6、20μmol/L DAPT、0.01mg/ml DXM和0.1%DMSO处理后12h、24h两个时间点BEAS-2b细胞存活率分别为98.01%、97.78%；98.57%、98.22%；98.61%、98.30%和99.20%、98.79%，与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），表明上述浓度的药物对BEAS-2b细胞无明显毒性作用。
3.B6对RSV复制增殖的抑制作用：
B6具有体外抑制RSV增殖作用，且随药物剂量的增加，抑制RSV增殖效应逐渐增强。10μmol/LB6在两个时间点（12h、24h）对RSV抑制率分别达49.95%和56.95%。
4.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后细胞病变程度：
E组RSV感染后，BEAS-2b细胞出现明显的CPE，形态凌乱并皱缩成团，细胞内出现大量异常颗粒，有明显的合胞体形成，且与12h相比，24h CPE现象更为显著。F组未见CPE现象。与E组相比，A、B、C、D组RSV感染的CPE现象较为不明显，表明B6、DAPT、DXM均可以抑制RSV感染引起的CPE。
5.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Notch1mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Notch1mRNA和蛋白表达量最少。与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），24h增加更显著；与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Notch1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以D组表达量最低；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
6.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Hes1mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Hes1mRNA和蛋白水平最低，与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），其中24h增加更明显；与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Hes1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.01），以D组表达量减少最明显（P＜0.05）；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
7.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Muc5ac mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Muc5ac mRNA和蛋白表达量最少，与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），24h增加更显著。与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Muc5ac mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以D组表达量最低；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
8.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后IL-25蛋白水平变化：
F组IL-25蛋白水平最低，与F组相比，E组蛋白水平明显增高（P＜0.01），24h增高更明显。与E组相比，感染RSV后12h和24h两个时间点A组、B组、C组、D组IL-25蛋白水平均明显减少（均P＜0.01），其中D组蛋白水平最低；A组、B组和C组同一时间点蛋白水平相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.01）。
结论：
1.在体外RSV感染引起Muc5ac表达增多，其机制可能与Notch1、Hes1、IL-25表达上调相关。
2.RSV感染后Notch1信号通路可以介导IL-25的释放，并上调Muc5ac表达，导致气道黏液高分泌。
3.姜黄素衍生物B6会抑制Notch1/Hes1信号通路介导的IL-25的释放，并参与调控RSV感染引起的气道黏液高分泌。
1.通过观察呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮（BEAS-2b）细胞后12h、24h Notch1、Hes1、黏蛋白5ac（Muc5ac）mRNA、蛋白表达情况和白细胞介素25（IL-25）蛋白水平的变化，探讨Notch1/Hes1信号通路在RSV感染气道黏液高分泌中的调控作用。
2.观察姜黄素衍生物（B6）、Notch通路γ-分泌酶抑制剂（DAPT）及地塞米松（DXM）对RSV感染BEAS-2b细胞Notch1、Hes1、Muc5ac及IL-25表达水平的影响，探讨姜黄素衍生物对RSV感染气道黏液高分泌的抑制效应及机制。
3.为临床应用姜黄素衍生物治疗RSV感染引起的气道黏液高分泌提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新思路。
方法：
1.建立RSV感染的细胞模型，将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至90%左右时，传代于六孔板中，随机分成6组：A组（B6+RSV组）、B组（DAPT+B6+RSV组）、C组（DAPT+RSV组）、D组（DXM+RSV组）、E组（RSV组）和F组（细胞对照组）。A组在RSV感染造模0.5h前予B6（10μmol/L）预处理，B组在B6预处理前先以DAPT（20μmol/L）预处理1h。造模开始前1h，D组加入DXM（0.01mg/ml）。A-E组以100TCID50RSV感染吸附BEAS-2b细胞2h，再加维持液继续培养至12h、24h收获细胞及上清液进行检测。
2.观察各组上述两个时间点细胞病变效应（CPE）情况；采用CCK8法检测B6、DAPT、DXM、DMSO对BEAS-2b细胞的毒性作用和B6对RSV的病毒抑制率。3.利用实时荧光定量（RT-PCR）检测上述12h、24h两个时间点各组Notch1、Hes1、Muc5ac mRNA表达情况。Western Blot法检测Notch1、Hes1、Muc5ac蛋白水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中IL-25蛋白水平。
结果：
1.RSV滴度测定：
本实验中RSV的TCID50为10-4.8/50μl，病毒攻击量为100TCID50。即10-2.8/50μl。
2.B6、DAPT、DXM及0.1%DMSO的细胞毒性：
10μmol/L B6、20μmol/L DAPT、0.01mg/ml DXM和0.1%DMSO处理后12h、24h两个时间点BEAS-2b细胞存活率分别为98.01%、97.78%；98.57%、98.22%；98.61%、98.30%和99.20%、98.79%，与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），表明上述浓度的药物对BEAS-2b细胞无明显毒性作用。
3.B6对RSV复制增殖的抑制作用：
B6具有体外抑制RSV增殖作用，且随药物剂量的增加，抑制RSV增殖效应逐渐增强。10μmol/LB6在两个时间点（12h、24h）对RSV抑制率分别达49.95%和56.95%。
4.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后细胞病变程度：
E组RSV感染后，BEAS-2b细胞出现明显的CPE，形态凌乱并皱缩成团，细胞内出现大量异常颗粒，有明显的合胞体形成，且与12h相比，24h CPE现象更为显著。F组未见CPE现象。与E组相比，A、B、C、D组RSV感染的CPE现象较为不明显，表明B6、DAPT、DXM均可以抑制RSV感染引起的CPE。
5.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Notch1mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Notch1mRNA和蛋白表达量最少。与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），24h增加更显著；与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Notch1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以D组表达量最低；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
6.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Hes1mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Hes1mRNA和蛋白水平最低，与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），其中24h增加更明显；与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Hes1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.01），以D组表达量减少最明显（P＜0.05）；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
7.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后Muc5ac mRNA表达及蛋白水平变化：
F组Muc5ac mRNA和蛋白表达量最少，与F组相比，E组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（P＜0.01），24h增加更显著。与E组相比，两个时间点A组、B组、C组、D组Muc5ac mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以D组表达量最低；而A组、B组和C组同一时间点mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.05）。
8.RSV感染及B6、DAPT、DXM干预后IL-25蛋白水平变化：
F组IL-25蛋白水平最低，与F组相比，E组蛋白水平明显增高（P＜0.01），24h增高更明显。与E组相比，感染RSV后12h和24h两个时间点A组、B组、C组、D组IL-25蛋白水平均明显减少（均P＜0.01），其中D组蛋白水平最低；A组、B组和C组同一时间点蛋白水平相近，差异无统计学意义，但仍高于F组（均P＜0.01）。
结论：
1.在体外RSV感染引起Muc5ac表达增多，其机制可能与Notch1、Hes1、IL-25表达上调相关。
2.RSV感染后Notch1信号通路可以介导IL-25的释放，并上调Muc5ac表达，导致气道黏液高分泌。
3.姜黄素衍生物B6会抑制Notch1/Hes1信号通路介导的IL-25的释放，并参与调控RSV感染引起的气道黏液高分泌。