胆盐水解酶（Bile salt hydrolase, EC3.5.1.24, BSH）能将结合胆盐水解成游离胆盐和甘氨酸/牛磺酸，这就促使体内由胆固醇从头合成结合胆盐以弥补损失，从而降低了体内的血清胆固醇水平。因此，通过口服产BSH的活细胞、纯酶以及相关制品治疗血清胆固醇过多症（hypercholesterolemia）将具有很大的应用前景。而且BSH成为目前国内外研究的热点之一。然而，关于BSH的降胆固醇机制、底物结合机制以及安全性等还存在争议。本文筛选了一株具有较高胆盐水解酶活性和良好的体外降胆固醇能力的乳酸菌，并利用双精氨酸信号肽将该菌的bsh基因在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行了分泌表达，接着对重组酶进行了性质分析和底物特异性改造，最后对其进行了食品级表达。主要研究结果如下：1)通过定性和定量的方法筛选到一株具有较高BSH活性和良好的体外脱除胆固醇能力的乳酸菌，并经过鉴定将其命名为植物乳杆菌BBE7。然后将该菌的bsh基因在E. coli的胞内进行了克隆和表达。通过分析发现该酶是一个由324个氨基酸组成的蛋白质，而且与其它来源的BSH相似度较高，属于N末端亲核水解酶家族。酶活测定的结果显示，重组菌胞内的BSH活性为1.85U mg-1，比野生菌中BSH的比酶活提高了13倍。2)成功利用双精氨酸信号肽将BSH分泌到E. coli的胞外。通过SDS-PAGE分析和酶活测定发现，与Sec途径的PelB信号肽相比，三种双精氨酸途径（Tat）的信号肽都能使BSH在重组菌的胞内和胞外进行表达，尽管大部分BSH都在胞内形成了包涵体，只有少数蛋白被分泌到胞外。由于信号肽DMSA的GRAVY值、稳定性和脂溶指数都高于其它两个信号肽，它对BSH的分泌效率最高。此外，4种宿主对BSH的表达效果差异很大，这是因为双精氨酸信号肽在同种（species）的不同菌株里的作用效果不同，所以可以找到信号肽和宿主的最佳组合使其有效分泌BSH。通过正交试验设计对重组菌的胞外BSH活性进行了优化，使其提高了68.1%。3)依次经过硫酸铵沉淀、透析、Ni²⁺柱和凝胶柱对重组菌发酵上清液中的BSH进行了分离纯化，得到了电泳纯的BSH，纯化倍数为39.34倍，总得率约为12.55%。并通过N端测序证实了胞外的BSH是通过Tat转运系统分泌出去的而不是由细胞渗漏造成的。重组BSH的最适反应pH为5.6-6.4，在pH7.0-8.0的范围内能保留96%的酶活；最适反应温度为37℃，40℃孵育60min能保留83.5%的酶活，而60℃孵育10min后几乎完全失活；10mM的EDTA和DTT分别可以使酶活增加45.1%和86.8%，氧化巯基的试剂Cu²⁺和高碘酸钠能强烈抑制BSH的活性，PMSF和其它金属离子对BSH都有不同程度的抑制作用；对甘氨结合胆盐的水解作用远远高于对牛磺结合胆盐的水解作用；其Vmax，Km，kcat和kcat/Km的值分别为142.8μmol （min mg）-1，2.07mM，88.127s-1和42.57L （s mmol）-1。4)氨基酸序列比对表明，当BSH的65位氨基酸为极性氨基酸时，BSH偏向于水解甘氨结合胆盐；而当其为非极性氨基酸时，BSH偏向于水解牛磺结合胆盐。通过同源结构模拟和叠加也发现，BSH的Tyr65位于底物脱氧胆酸（DCA）的异戊酸侧链附近。而且这个异戊酸侧链离C12位的羟基取代基很近，在这里增加极性的氨基酸会改变酶对相应底物的亲和力。并通过定点突变证实了65位氨基酸的极性的重要性，当它为C和N等极性氨基酸时，BSH就失活了；而当它为A、F和I等非极性氨基酸时，BSH就以活性酶的形式存在。而且突变体Y65A，Y65F和Y65I对牛磺结合胆盐的水解能力提高了（最高倍数达4倍多）。此外，底物的氨基酸部分、类固醇核的C7和C12位的羟基取代基都对酶对相应底物的水解能力有影响。5)使用质粒pNZ8149的筛选标记lacF和质粒pNZ8112的信号肽Usp45等食品级表达元件，实现了BSH在L. lactis NZ3900中的胞内和胞外的食品级表达。根据L. lactis的密码子偏好性，对bsh基因进行了密码子优化，从而使BSH在重组菌胞内和胞外的比酶活分别比原来提高了12倍和9.5%。使用带有两个负电荷的前导肽LEISSTCDA优化了信号肽的c端和成熟蛋白之间的电荷平衡，从而使bsh2编码的BSH的胞外比酶活提高了8.8%。同时使用密码子优化和前导肽LEISSTCDA使胞外BSH的比酶活提高了11.3%。此外，证明了该前导肽的两个负电荷是其发挥促进蛋白分泌的作用所必需的。