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青藏高原平均海拔4000米,世代栖息在这片高原的小哺乳动物面临着低氧而寒冷的气候挑战,在长期繁衍和适应进化中,这些动物形成了特别的环境适应机制,为我们研究环境适应性提供了天然的研究对象。高原鼢鼠(Myospalax baileyi)世居青藏高原高寒草甸(海拔3800-4500米),常年营地下生活,生境具有低氧、寒冷和高CO2的特点。甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)分布于陕甘地区的黄土高原(海拔800-1500米),同样营地下生活,经受低氧和高CO2的胁迫。鼠科双微体MDM2(Murine double minute 2)和 MDMX(Murine double minute X)是 MDM 家族中重要的原癌基因,也是p53的主要负调控分子。正常生理情况下,MDM2介导p53蛋白的泛素化降解,而MDMX是这个过程的关键辅助因子,二者共同抑制p53,使其蛋白维持低水平表达;MDMX除了辅助p53泛素化降解,还可以通过结合p53 DBD结构域,抑制p53对靶基因的转录活性。当机体面对DNA损伤应激时,MDM2/X促进p53蛋白的积累,并帮助p53 mRNA转录和翻译。最新研究发现,在肿瘤低氧微环境中,HIF-2α通过减少活性氧簇(ROS)的积累,促进AKT介导的MDM2磷酸化,抑制p53的蛋白表达与转录活性。因此p53,MDM2/X和HIF-2α之间存在复杂的互作。实验室以往研究发现,高原鼢鼠和根田鼠p53编码区的变异会影响细胞凋亡的适应性改变;而在以色列相邻但不同土壤微环境的两类盲鼹鼠中,p53启动子区的甲基化水平差异影响p53对靶基因的转录和细胞命运的改变,这种适应性的改变贡献给同域物种的形成。本研究中以高原鼢鼠和甘肃鼢鼠为主要研究对象,运用分子生物学、细胞生物学和生物信息学技术探讨MDM2/MDMX-HIF-2α-p53分子间相互作用在高原低氧环境适应中的潜在机制,获得如下结果:1、克隆了高原鼢鼠,甘肃鼢鼠,根田鼠和北美草原田鼠的MDMX编码区序列,高原鼢鼠和甘肃鼢鼠的MDM2启动子区序列以及甘肃鼢鼠HIF-2α编码区序列,并与人类、大鼠、小鼠和以色列盲鼹鼠等动物进行了基因比对分析,发现高原鼢鼠与甘肃鼢鼠的MDMX和HIF-2α氨基酸序列同源性极高,分别为99.60%和97.59%,与别的动物相比同源性为85%左右,高原鼢鼠和甘肃鼢鼠有共同的氨基酸变异位点,可能涉及磷酸化、乙酰化水平的改变。2、克隆了高原鼢鼠和甘肃鼢鼠肺脏MDM2启动子区序列,并利用生物信息学技术预测MDM2启动子区转录因子结合位点,高原鼢鼠和甘肃鼢鼠共有17种相同的转录因子。对MDM2启动子区甲基化水平进行检测,发现两种动物启动子区CpG岛分布位置相似,但整体甲基化水平有显著差异,大部分CG位点甲基化水平差异显著,共分析统计出10个差异显著的CG位点位于MDM2启动子区-166bp～-81 bp 之间。3、高原鼢鼠,甘肃鼢鼠肺、脾、肝组织中的MDM2、p53和Cited基因表达水平均显著高于平原实验室SD大鼠,脾组织中HIF-2α和VEGFR-2的基因表达显著高于SD大鼠,肝组织中HIF-2α基因表达也显著高于SD大鼠,但MDMX基因表达在三种组织均与SD大鼠无显著差异。SD大鼠暴露于不同时间、强度的低氧后,肺组织中p53表达显著下降,脾组织中HIF-2α和VEGFR-2显著上升,肝组织中p53表达显著下降。8%02低氧下,脾组织中MDM2、p53、HIF-2α、CITED和VEGFR-2基因表达均显著上升,肝组织中Cited基因表达显著上升,MDMX、p53和VEGFR-2基因表达显著下降。4、高原鼢鼠HIF-2α的S480变异贡献给HIF-2α转录活性的升高。常氧和低氧情况下,S480和A480组较T480组(人和大、小鼠相同)HIF-2α的低氧反应元件结合能力均显著上升。但在低氧后,S480和A480组的HIF-2α低氧反应元件结合能力均显著降低。S189变异在常氧和低氧下都对HIF-2α结合低氧反应元件影响不显著,在低氧后与低氧反应元件结合能力显著降低。5、高原鼢鼠、甘肃鼢鼠和SD大鼠的MDM2+p53、MDMX+p53、MDM2/X+p53共转入H1299或HEK-293T细胞。常氧下,高原鼢鼠MDM2/X不影响p53参与的细胞凋亡,而甘肃鼢鼠和大鼠MDM2/X共同导致了细胞凋亡的增加。低氧应激后细胞凋亡率均显著降低,高原鼢鼠MDM2/X显著抑制p53介导的细胞凋亡,而甘肃鼢鼠和大鼠MDM2和MDMX抑制凋亡无明显差异。在低氧应激的细胞凋亡下调过程中,p53发挥着重要作用。6、高原鼢鼠HIF-2α 480位点变异对细胞凋亡影响不显著。高原鼢鼠HIF-2α变异体(S480、T480和A480)和p53共转染后,低氧下均显著降低细胞的凋亡率。结果提示,高原鼢鼠和甘肃鼢鼠MDM2,MDMX和p53分子的自然变异演化贡献给高原环境适应性调节,在低氧下MDM2和MDMX促进p53的抗凋亡作用是高原鼢鼠适应特殊低下环境的策略,而其HIF-2α的480位点变异上调了对靶基因转录活性,可能贡献给高原鼢鼠地下极端环境的适应性。