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肝纤维化是慢性肝脏疾病发生发展过程中的共有病理反应，活化的肝星状细胞分泌ECM增多是其发病的主要特征，因此肝星状细胞（HSC）活化被认为是肝纤维化发生的关键环节，抑制HSC活化是抗肝纤维化治疗关键步骤。研究发现DNA甲基化在HSC活化过程中具有重要作用。为了进一步探讨DNA甲基化在肝纤维化中的作用机制，通过在体与离体两个方面观察DNA甲基化相关蛋白在肝组织与细胞中的变化，及其对HSC活化的影响，并探讨其部分作用机制。研究内容主要包括以下四个部分：1. PTEN在CCl4诱导的大鼠肝组织中的表达及甲基化的状态CCl4皮下注射建立大鼠肝纤维化模型，正常组10只、模型组20只。自处理之日开始，模型组大鼠皮下注射50%CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次，共12周；正常组给予同样剂量花生油皮下注射，在12周末，取肝组织进行病理组织学和Masson胶原染色检测，并检测PTEN、α-SMA在大鼠肝组织中的表达变化。实验结果表明，在肝纤维化形成过程中PTEN表达降低。利用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）检测PTEN甲基化的状态，发现在CCl4诱导的大鼠肝组织中PTEN发生了高甲基化。2. DNA甲基化抑制剂使PTEN发生去甲基化及恢复了PTEN的表达，从而抑制HSC的活化以大鼠肝星状细胞株HSC-T6为研究对象，利用TGF-β15ng/ml刺激30m后，加入不同浓度的5-AzadC温育48h，RT-PCR方法检测PTEN，α-SMA，Collagen I的mRNA表达变化；免疫印迹观察PTEN，α-SMA蛋白的表达。利用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）检测PTEN甲基化的状态。实验结果表明，在体外TGF-β1诱导HSC-T6中PTEN高甲基化，5-AzadC能使高甲基化的PTEN去甲基化进而恢复PTEN表达，并可抑制HSC-T6的活化。3. DNMT1调控PTEN表达及其对甲基化的作用研究根据DNMT1的碱基序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内，荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6的细胞增殖变化；RT-PCR检测DNMT1、α-SMA、Collagen I mRNA的表达；免疫组化，免疫荧光及Western Blot检测DNMT1、α-SMA蛋白的表达。结果发现，靶向沉默DNMT1可明显降低TGF-β1刺激的HSC-T6中α-SMA、Collagen I基因的表达水平；MSP-PCR检测显示，靶向封闭DNMT1基因的表达可使PTEN去甲化，进而抑制HSC-T6细胞的活化增殖。实验结果表明，DNMT1通过介导PTEN甲基化来促进HSC-T6活化。4. DNA甲基化抑制剂和DNMT1沉默对PTEN下游信号通路的影响Western blot检测发现，CCl4诱导的肝组织和体外TGF-β1诱导的肝星状细胞活化中p-ERK，p-AKT的表达水平，DNA甲基化抑制剂和DNMT1沉默可抑制p-ERK，p-AKT表达水平。表明PTEN高甲基化激活了下游信号通路进而促进肝纤维化的形成。