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制川乌-白芍药对载于张仲景《金匮要略》中的方剂“乌头汤”,临床上常用于治疗“风湿痹证”。苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine,BAC)为制川乌有效成分之一;芍药苷(paeoniflorin,PAE)为白芍的主要有效成分。研究发现制川乌配伍白芍可以增强制川乌抗炎、镇痛等治疗效果,也能降低其对心肌、神经等的毒副作用。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是具有高发病率、高致畸率和低治愈率临床特点的慢性、全身性自身免疫性疾病,但目前尚未有苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷对人类风湿性关节炎细胞的作用以及作用机制的相应研究与报道,因此本论文拟采用人类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞(MH7A),研究苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷的作用效果及对MAPK-NF-κB信号通路的影响,为制川乌配伍白芍治疗类风湿性关节炎提供理论依据,并为有效成分的配伍应用奠定基础。实验方法:一、MTT法测定细胞生长曲线,不同浓度的LPS、TNF-α处理细胞24h、48h、72h,据细胞活力选择复制炎症细胞模型的条件。二、苯甲酰乌头原碱、芍药苷不同浓度分别处理MH7A细胞24h、48h、72h,据单用作用效果选择配伍作用浓度;配伍浓度组处理细胞模型,应用双因素方差分析法分析药物协同作用效果;流式细胞术分析对细胞周期和凋亡的影响。三、酶联免疫吸附测定法测定不同处理条件下细胞中IL-1β、IL-6、MMP-3、MMP-9、MMP-13五种炎症因子的表达量;蛋白免疫印迹法检测细胞中MAPK p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK 1/2、p-ERK 1/2和NF-κB p-p65、IκB-α蛋白以及caspase-3凋亡蛋白的表达,用实时荧光定量PCR测定MAPK1和NF-κB mRNA的表达量。实验结果:一、正常MH7A细胞的增殖周期为4~5天;增殖模型中,LPS和TNF-α均有显著促增殖的作用(P<0.01),LPS 10μg/ml和TNF-α10ng/ml的效果最佳。二、对正常细胞,BAC和PAE单用分别从1μg/ml和50μg/ml开始发挥抑制作用;对模型细胞,BAC和PAE单用分别从10μg/ml和50μg/ml开始发挥抑制作用,故选择10、100、400(μg/ml)三个浓度分别进行配伍;经双因素方差分析,选择TNF-α作为诱导因子,10、100(μg/ml)两个浓度分别进行配伍;细胞周期和凋亡实验中,部分配伍组均有增效作用。三、各处理组可不同程度抑制TNF-α诱导的四种炎症因子的异常分泌,抑制MAPK p-p38、p-ERK 1/2蛋白和NF-κB p-p65蛋白以及MAPK1和NF-κBmRNA的表达,增加caspase-3蛋白表达,部分配伍组显示出配伍优势。实验结论:苯甲酰乌头原碱和芍药苷单用或配伍可显著抑制LPS或TNF-α诱导的MH7A细胞异常增殖,并能阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,配伍显现出配伍增效的优势。两者单用或配伍均可抑制TNF-α诱导的炎症因子过表达,抑制信号通路转导蛋白的表达,抑制MAPK和NF-κB信号通路激活。