第一章青少年特发性脊柱侧凸可溶性瘦素受体水平异常的机制研究背景青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是最常见的三维脊柱畸形,最常累及10-16岁的青春期女孩,若未及时发现和干预,脊柱侧凸可不断加重以致影响呼吸、循环功能,甚至可导致患者死亡。然而目前关于AIS的病因和发病机制仍不明确。既往研究发现AIS患者具有异常的生长特征。AIS患者与正常同龄青少年相比具有较高的校正身高和生长高峰速度、较低的体重和体质量指数(bodymassindex,BMI)以及较较低的骨密度,而这种异常生长特征被认为可能与AIS的发生发展相关。诸多学者都提出假说试图解释AIS患者的这种异常生长特征,其中瘦素代谢异常假说获得了广泛关注。瘦素是一种调节青春期女孩生长发育的一种重要的激素,主要由脂肪组织分泌,可穿透血脑屏障与下丘脑的瘦素受体结合,通过负反馈调节机制调控骨和脂肪组织的生长代谢。AIS患者的这些异常生长特征高度提示可能存在瘦素代谢调节系统的异常。可溶性瘦素受体(soluble leptin receptor,sOB-R)是调控瘦素生物利用度和跨血脑屏障运输的关键因素之一,它是由跨细胞膜瘦素受体(主要为OB-Ra和OB-Rb)的膜外部分经去整合素金属蛋白酶(A Disintegrin and Metalloproteinase,ADAM)水解后溶于外周血后形成。sOB-R可通过结合游离瘦素调节外周痩素的生物利用度,并可促进瘦素跨血脑屏障运输,从而增强中枢瘦素的活性。既往研究显示,AIS患者外周血sOB-R水平高于正常对照,且游离瘦素指数(血清瘦素/可溶性瘦素受体水平,FLI,反应瘦素生物利用度)则低于正常对照,高度提示AIS患者存在因sOB-R水平异常导致的瘦素生物利用度异常,并且这种瘦素生物利用度异常可能是AIS患者异常生长特征和脊柱侧凸发生发展的重要原因。然而,目前对于AIS患者外周血sOB-R水平异常的机制仍缺乏研究。由于ADAM是调节sOB-R生成的关键酶,因此本研究将进一步探究ADAM是否在AIS外周血sOB-R水平异常中发挥作用。第一节可溶性瘦素受体生成机制的研究目的:通过构建OB-Ra和OB-Rb过表达稳转细胞株探究与生成sOB-R相关的ADAM的亚型。方法:首先构建人瘦素受体(OB-Ra和OB-Rb)过表达慢病毒载体,然后将慢病毒载体转入表达各种ADAM亚型的293T细胞中,从而建立OB-Ra和OB-Rb过表达稳转细胞株。然后将过表达稳转细胞株分组,分别加入ADAM10抑制剂GI254023X(GI)、ADAM10 和 ADAM17 抑制剂 GW280264X(GW),通过检测并比较各组间细胞培养液上清中sOB-R的浓度,确认与sOB-R生成相关的ADAM亚型。结果:1.OB-Ra和OB-Rb过表达细胞株荧光表达率在80-90%以上,均能高水平合成相应瘦素受体亚型mRNA,稳转细胞株构建成功;2.OB-Ra过表达细胞GI组和GW组培养24小时后培养基中sOB-R含量较对照组分别下降45.0%和51.4%,培养48小时后较对照组分别下降52.1%和61.0%。3.OB-Rb过表达细胞GI组和GW组培养24小时后培养基中sOB-R含量较对照组分别下降38.5%和36.8%,培养48小时后较对照组分别下降46.2%和51.1%。结论:OB-Ra和OB-Rb过表达稳转细胞均能高表达相应瘦素受体亚型,稳转细胞株构建成功。跨膜瘦素受体水解生成可溶性瘦素受体依赖于ADAM蛋白酶,其中ADAM 10发挥主要作用,ADAM 17发挥次要作用。第二节青少年特发性脊柱侧凸去整合素金属蛋白酶水平与异常可溶性瘦素受体水平的关系目的:评估AIS患者体内ADAM10和ADAM17的表达情况,从上游探究AIS sOB-R水平升高的原因,从而进一步阐明瘦素生物利用度异常与脊柱侧凸病因学之间的关系。方法:收集30例AIS患者和30例同龄正常青少年的外周血,提取白细胞中RNA,通过 Real-time PCR 方法检测 OB-Ra、OB-Rb、ADAM10 和 ADAM17 mRNA的合成水平,并通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测AIS患者和对照组血清中瘦素、sOB-R、ADAM10和ADAM17的含量,比较AIS患者和同龄正常青少年之间是否存在差异。结果:AIS患者血清瘦素水平显著低于正常对照组(7.3 ± 4.8 ng/ml vs.8.7 ± 4.2 ng/ml,P=0.044),sOB-R 水平显著高于正常对照组(26.8 ±6.9 ng/mlvs.22.5 士6.1 ng/ml,P = 0.012)。AIS患者ADAM10 mRNA合成水平和血清含量均显著高于对照组(P<0.05),而ADAM17的mRNA合成水平和血清含量与对照组无显著差异。结论:AIS患者的外周血sOB-R含量和ADAM10表达水平均显著高于正常青少年,而跨膜瘦素受体表达水平与正常青少年无显著差异,AIS患者高sOB-R水平可能是由ADAM10表达升高引起。第二章脊柱畸形相关临床研究第一节Lenke 1型青少年特发性脊柱侧凸后路矫形术后颈椎矢状面最终形态的预测因素:一项长期随访研究目的:1.评估Lenke 1型AIS患者行后路矫形手术术前、术后即刻和末次随访时的颈椎矢状面形态,分析Lenke1型患者术前、术后的颈椎矢状面代偿模式。2.寻找可以预测AIS最终(末次随访)颈椎矢状面形态的术前或术后即刻的影像学参数。方法:回顾性分析44例于本院脊柱外科行后路矫形手术、术后随访至少5年的Lenke1型AIS患者。收集所有患者的术前、术后即刻和末次随访的影像学和临床资料。在站立位全脊柱正侧位X线片上测量以下影像学参数:胸主弯Cobb角(Main thoracic curve,MTC)、上胸弯 Cobb 角(Proximal thoracic curve,PTC)、颈椎前凸角(Cervical lordosis,CL)、颈椎矢状垂直偏距(Cervical sagittal vertical axis,CSVA)、T1 倾斜角(T1 slope,T1S)、上胸椎后凸角(Upper thoracic kyphosis,UTK)、主胸椎后凸角(Main thoracic kyphosis,MTK)、全胸椎后凸角(Globalthoracickyphosis,GTK)、腰椎前凸角(Lumbarlordosis,LL)、骶骨倾斜角(Sacrum slope,SS)、骨盆入射角(Pelvicincidence,PI)、骨盆倾斜角(Pelvictilt,PT)。通过Pearson相关性分析、逐步多元线性回归分析和受试者工作特征曲线(Receiver operator characteristic,ROC)寻找可以预测最终(末次随访)颈椎矢状面形态的术前和术后即刻的影像学参数。结果:44例Lenke 1型AIS患者CL由术前的-6.6°± 8.8°改善为术后即刻的-3.8°±8.7°,并在末次随访时改善为0.5°±7.3°。CSVA术后减小,但差异未达统计学意义。35例(79.5%)患者术前颈椎矢状面形态表现为后凸或曲度变直,其中9例(25.7%)患者在末次随访时获得了前凸的颈椎矢状面形态;9例(20.5%)患者术前颈椎矢状面形态表现为前凸,且在末次随访时均维持前凸状态。Pearson相关性分析表明术前CL仅与T1S和UTK相关,而术后CL与T1S、UTK和GTK均相关。多元线性回归分析得到最终CL的预测方程:最终CL =-2.80+ 0.51 ×术前CL + 0.53 ×术后即刻TIS。ROC曲线显示术前CL ≥-4.5°和术后即刻T1S ≥ 11.3°是最终颈椎矢状面形态为前凸型的预测因素。结论:随着后路脊柱畸形矫形术后整体和胸椎局部的矢状面形态的重建,Lenke 1型AIS患者的CL显著增大,颈椎矢状面形态显著改善。由于手术的干预,术前和术后的颈椎矢状面代偿模式存在差异。对于Lenke1型AIS患者,术前CL和术后即刻T1S可作为预测最终颈椎矢状面形态的预测因素。第二节硬膜外脂肪增多症一一一个易忽视的脊柱后凸畸形继发性椎管内异常目的:验证如下猜想:SEL是各种脊柱后凸畸形常见的继发性椎管内异常。方法:回顾性分析16例先天性脊柱后凸(Congenitalkyphosis,CK)患者、40例休门氏病(Scheuermann kyphosis,SK)患者、13例结核性脊柱后凸(Tuberculotic kyphosis,TK)患者,以及69例年龄和性别匹配的正常对照的临床和影像资料。记录患者的体质量指数(body mass index,BMI),在全脊柱侧位X线片上测量后凸Cobb角。在全脊柱矢状面MRI上测量以下参数:顶椎区硬膜外脂肪矢状径(EFA)、硬膜囊矢状径(DSA),以及非后凸区硬膜外脂肪矢状径(EFN)、硬膜囊矢状径(DSN)。分别计算顶椎区和非后凸区的硬膜外脂肪比(EFR):EF/(EF + DS)。结果:CK组、SK组和TK组患者的EFA和和EFRA显著高于正常对照组(P<0.05)。7 例 CK 患者(43.8%),8 例 SK 患者(20.0%),和 11 例 TK 患者(84.6%)达到SEL的诊断标准,而正常对照组仅分别有1例(6.3%)、1例(2.5%)和 0 例(0%)达到 SEL 诊断标准(P = 0.019,0.014,<0.001)。Spearman相关性分析显示,在三组患者中,脊柱后凸Cobb角与硬膜外脂肪量均存在显著相关性。结论:SEL是各种脊柱后凸畸形常见的继发性椎管内异常。由于过多的硬膜外脂肪可压迫脊髓产生神经损害,因此脊柱外科医生应重视该现象。第三节Chiari畸形Ⅰ型后颅窝减压术后颈椎管再塑形目的:评估Chiari畸形Ⅰ型(Chiari malformation type Ⅰ,CMI)伴脊髓空洞患者后颅窝减压术(posterior fossa decompression,PFD)后颈椎管直径和锥度是否改变,并分析其与空洞缓解是否相关。方法:回顾性分析39例于本院脊柱外科行PFD手术、随访至少一年的CMI伴脊髓空患者的影像学资料。将患者分为PFD术后脊髓空洞改善组(syrinx-improved,SI 组)和脊髓空洞未改善组(syrinx-unimproved,SU 组),SI 组共有30例患者,SU组共有9例患者。在T2加权相MRI正中矢状位扫描层面上测量C2-7节段颈椎管前后径,以椎体节段为横坐标椎管前后径为纵坐标绘制散点图,利用Excel软件绘制二元回归方程趋势线,该趋势线的斜率记为颈椎管锥度(mm/节段)。比较术前和术后以及SI组和SU组间颈椎管前后径和椎管锥度是否存在差异。结果:在SI组中,PFD术后各节段颈椎管前后径均减小,其中C2、C3、C4、C6和C7减小程度达到统计学意义(P = 0.001,0.011,0.028,0.047和0.045),而在SU组中,各节段术前、术后颈椎管前后径均无显著变化。SI组C2-4节段的椎管锥度从术前的-1.38 ± 0.78 mm/节段显著减小为术后的-1.13 ± 0.95 mm/节段(P=0.024),然而C4-7节段的椎管锥度则无显著改变(P=0.553)。而在SU组中,C2-4和C4-7节段的椎管锥度术前、术后均无显著改变(P= 0.867,0.980)。结论:PFD术后脊髓空洞缩小的CMI患者颈椎管前后径减小,提示颈椎管随着脊髓空洞的改善而再塑形。另外,该再塑形过程使颈椎管锥度减小,颈椎管锥度减小可改善脑脊液动力学并进一步促进脊髓空洞的缩小。