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肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。由于肺癌病人早期症状不典型，同时缺乏敏感的筛查指标及有效的早期确诊方法，大多数患者就诊时已经处于疾病中晚期，错过最佳治疗时机。肺癌患者另一个预后不良的重要原因是容易复发和远处转移，即使早期患者在肿瘤完全切除的情况下也大多死于复发和转移。因此进一步研究肺癌转移的的分子机制，将有助于预防肺癌复发和转移。miRNAs是一种新型肿瘤标记物。致癌类miRNAs通过下调抑癌基因的表达而促进肿瘤细胞的生长，抑癌类miRNAs在转录后水平通过抑制原癌基因的表达而抑制肿瘤。深入研究miRNAs在肿瘤发生、发展中的作用，将为肺癌的诊断和治疗提供新的方案和新的靶点。1.筛选差异表达的miRNAs以两株不同转移能力的肺癌细胞株95C和95D为研究对象。提取总RNA后，利用miRNAs芯片对95C和95D的miRNA谱系分析筛选，获得具有差异表达的miRNAs。结果发现在95C和95D中，microRNAs表达存在差异：其中miR-544a、miR-320、miR-22、miR-103、miR-565和miR-23a等microRNAs，在高转移肺癌细胞株95D中高表达；miR-135b、miR-455-5p、miR-196a、miR-448、miR-888、miR-193a-5p、miR-28-5p和miR-139-5p等microRNAs，在低转移肺癌细胞株95C中高表达。miRNA芯片检测灵敏度较高，但存在一定的假阳性率。因此通过QPCR对差异miRNA进行验证，从而降低假阳性率。QPCR结果显示，miR-544a在高转移细胞株95D中的相对表达水平上调，其相对表达水平约是95C的3倍。该结果与芯片检测结果一致。2. miR-544a通过下调CDH1、上调Vimentin促进肺癌细胞的侵袭能力利用TargetScans数据库，检索到miR-544a与CDH1、GSK-3β有高分数结合，提示CDH1、GSK-3β可能是miR-544a的靶基因。本实验进而采用双荧光素酶报告系统来加以验证。在CDH1或GSK-3β野生型重组质粒中，与阴性对照组相比，转染miR-544a mimic后，荧光强度比值明显降低。结果表明CDH1、GSK-3β是miR-544a的靶基因。进而采用细胞转染的方法，将miR-544a mimic转染到低转移肺癌细胞株95C中，进行Transwell侵袭实验、划痕实验、Western blot等实验检测转染细胞侵袭能力的变化以及CDH1、Vimentin等蛋白表达水平的变化。发现转染细胞侵袭能力增强、CDH1下调、Vimentin上调。3. miR-544a通过下调GSK-3β使肺癌细胞获得肿瘤干细胞的特征将miR-544a的序列克隆到pBaBe-puro载体中，构建了能表达成熟miR-544a的载体，进而转染95C和95D，经QPCR验证：获得了稳定表达miR-544a的细胞系。进一步通过Western blot和肿瘤球悬浮培养实验研究miR-544a与肿瘤干细胞的关系。Western blot实验结果显示，95C、95D转染miR-544a后，GSK-3β表达降低，β-catenin和CD133表达增高。结合以上实验结果，表明GSK-3β作为miR-544a的靶基因，受到miR-544a的抑制，导致GSK-3β下降；GSK-3β下降后，β-catenin的降解减少，其浓度升高，激活了Wnt/β-catenin信号通路，诱导肿瘤细胞侵袭、转移，增殖能力增强。本实验还发现，95C、95D转染miR-544a后，肿瘤干细胞标志CD133表达增高，转染细胞能形成肿瘤球，说明转染miR-544a的95C细胞具有了肿瘤干细胞的特征。从以上实验结果，得出结论如下：1）miR-544a在肺癌高转移细胞株95D中呈高表达。2）CDH1、GSK-3β为miR-544a的靶基因。3）miR-544a可以下调CDH1，诱导细胞发生EMT，促进细胞的侵袭和转移。4）miR-544a可以直接下调GSK-3β来激活Wnt/β-catenin信号通路，上调CD133，使细胞形成肿瘤球，具有了肿瘤干细胞的特征。