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研究背景:近年来,全世界糖尿病患者数量急速增长,我国已成为糖尿病人口大国。根据上海市内分泌代谢病研究所与中国疾病预防控制中心组成的研究团队在2010年进行的调查研究和推算,中国成人糖尿病患病率已上升至11.6%。据估计,糖尿病患者并发心脏疾病的风险是非糖尿病者的2倍到3倍,心血管疾病是糖尿病患者死亡的首要原因,其中以缺血性心脏病为最致命的威胁。心肌缺血/再灌注(Myocardial Ischemiareperfusion,MI/R)损伤导致的心肌细胞坏死、凋亡和心室重构是急性心肌梗死血管开通后心功能不全的最主要病理生理学基础。研究显示,糖尿病患者心肌梗死后的病死率明显升高,几乎是非糖尿病患者的两倍,提示糖尿病心肌MI/R损伤程度加重,但机制尚未阐明。探索糖尿病心肌缺血易损的具体机制,研究潜在的针对性保护靶点,对临床防治糖尿病合并缺血性心脏病具有重要意义。心肌细胞的坏死和凋亡是参与心脏疾病发生发展的重要病理途径。以往,心肌细胞凋亡作为程序性死亡方式受到极大的重视;而心肌坏死被认为是被动的细胞事件并且难以有效控制。由于心肌缺血导致的细胞死亡以坏死为主要形态学表现;坏死还引起严重的炎症反应,导致损伤级联放大。坏死对心肌的危害更为强烈,其研究本应更受重视。程序性坏死(necroptosis)作为一种死亡受体介导的caspase非依赖性细胞程序性死亡模式为细胞死亡机制学说带来了重大突破。Necroptosis及其调控通路的发现和确认使得对坏死进行调控成为可能。近年研究发现,心肌细胞程序性坏死在心肌梗死、缺血再灌注损伤和心力衰竭等严重心脏病理生理状况中发挥至关重要的作用。新近研究证实:心肌RIP3与Ca MKII是心肌程序性坏死信号通路中的关键蛋白,RIP3可直接结合Ca MKII使其磷酸化;另一方面,ROS可间接氧化Ca MKII,进而导致心肌程序性坏死。由此可见,RIP3/Ca MKII信号通路的激活状态与MI/R损伤关系密切。但目前为止,在糖尿病状态下心肌MI/R损伤过程中,心肌程序性坏死的严重程度;RIP3-Ca MKII通路的激活状态;该信号机制是否参与了糖尿病心肌缺血易损性增加等重要问题有待进一步的阐明和分析。基于上述思考,本课题旨在从离体和在体动物实验观察RIP3/Ca MKII信号通路在正常和糖尿病心肌MI/R过程中的差异与变化,探讨糖尿病心肌缺血易损的新机制,为临床治疗糖尿病合并缺血性心脏病提供新的治疗靶点和实验依据。研究目的:1.明确心肌程序性坏死是否参与糖尿病心肌缺血易损;2.探讨糖尿病状态下MI/R心肌RIP3-Ca MKII通路激活状态以及心肌程序性坏死的程度;3.明确能否针对RIP3-Ca MKII信号通路减少糖尿病心肌MI/R过程中的程序性坏死,有效保护心脏功能,提高生存率。实验方法:本研究以C57小鼠为研究对象,采用STZ诱导糖尿病模型。在此基础上建立小鼠急性MI/R模型(缺血30min/再灌注4h)。通过伊文氏蓝/TTC双染色法计算I/R心肌梗死面积,超声心动图检测心脏收缩舒张功能。根据I/R心肌伊文氏蓝通透区的面积占比和血清LDH水平评估心肌程序性坏死程度。通过Western Blot法检测RIP3-Ca MKII信号的蛋白表达水平和磷酸化/氧化水平,确定心肌Ca MKII激活程度。采用腺病毒为载体的RIP3-si RNA,Ca MKII抑制剂KN-93和Ca MKII磷酸化/氧化位点突变来验证抑制Ca MKII对糖尿病缺血心肌程序性坏死的影响。实验结果:1.与对照组小鼠相比,以40mg/kg的剂量连续5天腹腔注射STZ溶液可有效诱导C57小鼠糖尿病状态:在注射后的第5周进行观察和测量,处理组小鼠出现1型糖尿病小鼠模型的特征,其体重、心重、心率及心重/胫骨长度明显降低,空腹血糖值高于10mmol/L,IPGTT中60分钟时间点血糖值高于15mmol/L,证实1型糖尿病模型造模成功。2.通过检测心肌伊文氏蓝通透区面积和血清LDH水平,伊文氏蓝/TTC双染色法测定心肌梗死面积,超声心动图评估心功能水平,我们明确证实:糖尿病组心肌MI/R后心肌坏死水平较对照组增高35%,心肌梗死面积显著增加,MI/R后4周时心脏收缩舒张功能显著降低,60天生存率明显降低。这些结果表明,糖尿病状态下MI/R导致的心肌坏死显著加重;心肌程序性坏死可能参与了糖尿病心肌缺血易损。3.为进一步明确糖尿病心肌MI/R后程序性坏死的信号机制,本研究在小鼠心肌缺血30min后于不同的再灌注时间点进行持续观察,动态评估心肌Ca MKII磷酸化和Ca MKII氧化水平。结果显示,糖尿病组和对照组心肌Ca MKII氧化水平在MI/R开始后即出现升高,于再灌注10分钟达到峰值,1小时后恢复至再灌注前的水平。但是,糖尿病组MI/R心肌的Ca MKII氧化峰值水平较对照组有明显增高16%;并且,再灌注30分钟后Ca MKII磷酸化水平出现升高,更为重要的是:糖尿病组MI/R过程中心肌磷酸化Ca MKII于再灌注1小时即达到峰值,峰值水平出现时间较对照组显著提前。上述发现提示:糖尿病状态下MI/R心肌Ca MKII氧化水平显著增加并伴随Ca MKII磷酸化升高提前出现,时间和强度的异常激活状态共同导致心肌程序性坏死增强,恶化糖尿病心肌MI/R损伤。4.为明确Ca MKII信号在心肌程序性坏死中发挥的作用,本研究在离体心肌细胞实验中将Ca MKII的磷酸化位点和氧化位点突变来实现Ca MKII抑制。结果显示,Ca MKII磷酸化位点突变组,Ca MKII氧化位点突变组和Ca MKII磷酸化位点/氧化位点双突变组心肌细胞在高糖条件缺氧复氧处理后,细胞存活率较对照组均有显著上升。因此,我们的结果表明:Ca MKII的磷酸化和氧化均介导了心肌程序性坏死,及早抑制Ca MKII异常激活可能是有效的心肌保护措施。5.针对糖尿病MI/R心肌程序性坏死中Ca MKII信号的提前及增强的异常激活,本研究分别对比了早期使用(缺血前15分钟,腹腔内注射给药)和晚期使用(再灌注开始时,腹腔内注射给药)Ca MKII的广谱抑制剂KN-93对糖尿病I/R心肌程序性坏死中Ca MKII信号激活的影响。结果显示:缺血前15分钟早期给予KN-93可以有效抑制糖尿病MI/R心肌程序性坏死,减少心肌梗死面积及提高远期生存率;而再灌注后晚期给予KN-93,只能部分减少糖尿病MI/R心肌程序性坏死,心肌保护作用明显减弱。6.为阐明RIP3对Ca MKII信号在糖尿病心肌MI/R中的调控作用对心肌程序性坏死的影响,本研究检测了糖尿病I/R心肌中RIP3的表达情况,并通过Co-IP实验检测RIP3与Ca MKII的相互作用。结果发现,糖尿病MI/R心肌RIP3水平较对照组心肌显著升高;并且:糖尿病I/R心肌中RIP3与Ca MKII的结合作用也有明显增强。该结果提示RIP3可能是糖尿病心肌Ca MKII激活的直接作用因子。7.为进一步研究是否可通过抑制RIP3起到抑制心肌程序性坏死的作用进而保护糖尿病I/R心肌,本研究采用腺病毒包装的si RNA在体敲低糖尿病心肌RIP3(Ad-RIP3si RNA)水平,并检测其ROS生成水平,程序性坏死程度和Ca MKII的磷酸化和氧化激活水平。结果显示,I/R手术前48小时行心肌注射Ad-RIP3 si RNA可有效降低糖尿病心肌RIP3水平;抑制RIP3能有效抑制糖尿病I/R心肌的ROS水平,有效降低MI/R过程中Ca MKII的磷酸化和氧化激活水平,最终抑制心肌程序性坏死,有效抑制糖尿病心肌MI/R损伤程度,发挥心肌保护作用。研究结论:1.本研究首次证实:糖尿病状态下的MI/R心肌Ca MKII氧化水平显著增加并伴随Ca MKII磷酸化升高提前出现,共同导致心肌程序性坏死激活时间提前,水平增强,恶化糖尿病心肌MI/R损伤。2.RIP3是糖尿病心肌Ca MKII异常激活的重要调控因子。3.针对RIP3-Ca MKII信号抑制糖尿病I/R心肌的程序性坏死可有效减轻糖尿病心肌缺血易损,发挥心肌保护作用。