本论文系统研究了丝氨酰-tRNA合成酶(SARS)介导蛋氨酸(Met)在奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成中的功能及其作用机制。首先,通过转录组学和蛋白组学联合分析,检测不同质量粗饲料饲喂奶牛后乳腺差异表达基因和蛋白,并对其进行功能解析,重点关注氨酰基-tRNA合成酶(AARS)的差异表达谱,并筛选出差异表达最显著的AARS(即SARS)。继而,利用原代奶牛乳腺上皮细胞体外培养模型,研究了 SARS对Met的响应规律;进一步从Met转运/摄取和Met利用两个视角,阐明了 SARS与Met供应及酪蛋白合成之间的相互作用关系,解析了 SARS介导Met通过相关信号通路调节酪蛋白合成的分子机制。研究可进一步丰富奶牛乳腺氨基酸(AA)营养理论,为定向调控乳成分特别是乳蛋白合成提供理论依据,最终实现提高乳蛋白产量和质量、改善乳品质的目标。1不同质量粗饲料对奶牛乳腺转录表达谱和蛋白表达谱的影响试验研究了不同质量粗饲料饲喂奶牛后乳腺转录表达谱和蛋白表达谱(重点关注AARS的差异表达谱)的变化规律。选取12头健康经产奶牛,按产奶量和泌乳天数随机分为两组,每组6头,分别饲喂苜蓿日粮(对照组,高质粗饲料)和玉米秸秆日粮(处理组,低质粗饲料)。日粮主要区别为粗饲料来源(DM):(1)23%苜蓿+7%羊草(AH),(2)30%玉米秸秆(CS)。试验持续14周,试验完成后采集奶牛乳腺组织,利用RNA-seq转录组学和iTRAQ定量蛋白组学技术检测并分析奶牛乳腺转录表达谱和蛋白表达谱(尤其关注AARS表达谱)的差异。结果发现,与苜蓿组相比,玉米秸秆组奶牛乳腺组织转录谱发现1,631个差异转录本,其中1,046个上调转录本(Fold change>1.5;P<0.05)、585个下调转录本(Fold change＜0.67;P＜0.05);与苜蓿组相比,玉米秸秆组奶牛乳腺组织蛋白谱发现346个差异蛋白,其中138个上调蛋白(Fold change>1.2;P<0.05)和208个下调蛋白(Fold change ＜0.83;P＜0.05);乳腺转录谱和蛋白谱联合分析发现存在40个共同差异基因,其中18个同步上调,15个同步下调,另外7个差异基因在mRNA和蛋白水平表达不一致。进一步通过GO功能注释和KEGG Pathway分析发现,上调基因/蛋白主要参与脂肪酸的氧化代谢和蛋白质降解等生物学过程;而下调基因/蛋白主要参与能量代谢、蛋白合成和细胞生长发育等生物学过程。结果提示,饲喂不同质量粗饲料日粮后奶牛乳腺的转录表达谱和蛋白表达谱明显不同,玉米秸秆主要通过降低能量供应、减少蛋白合成、促进蛋白降解和阻碍乳腺细胞生长发育等过程而减少奶牛乳腺乳蛋白合成。另外,玉米秸秆可显著降低奶牛乳腺中AARS(尤其是SARS)的表达进而降低奶牛乳腺乳蛋白产量,提示AARS(如SARS)在维持奶牛乳腺泌乳和乳蛋白合成中发挥重要作用。2奶牛乳腺上皮细胞SARS对Met的响应规律研究2.1奶牛乳腺上皮细胞SARS对Met的响应性研究试验研究了奶牛乳腺上皮细胞SARS对Met的响应性。试验采用原代奶牛乳腺上皮细胞,培养至90%融合,先用饥饿培养基(不含FBS)过夜培养12h,使细胞处于同一分化状态。采用免疫印迹法结合免疫染色法对SARS在奶牛上皮细胞的表达分布进行检测;研究奶牛乳腺上皮细胞中不同AARS对Met的响应表达,采用缺失和添加Met的培养基处理细胞24 h,采用RT-PCR方法进行检测;研究Met浓度对奶牛乳腺上皮细胞SARS的表达影响,培养基中添加不同浓度的 Met(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、2.4mMMet,其中 OmM 添加组为空白对照)分别处理细胞24h,采用免疫印迹法进行检测;研究Met不同处理时间对奶牛乳腺上皮细胞SARS的表达影响,先用缺失Met的培养基培养12 h,继而添加0.6mM/LMet的培养基分别处理10min、0.5h、1h、6h和12h;同样先采用含0.6 mM/L Met的培养基培养12 h,然后采用缺失Met的培养基分别处理同样的时间点,利用免疫印迹法进行检测。结果发现,SARS主要分布于奶牛乳腺上皮细胞的细胞胞浆,少量存在于线粒体;Met显著促进了 SARS、MARS和CARS的表达(P<0.05);0.6mMMet对SARS的促表达作用最强(P<0.05);Met处理细胞6 h对奶牛乳腺上皮细胞SARS蛋白表达影响最明显。以上结果提示,Met能明显促进奶牛乳腺上皮细胞SARS的表达,且这种响应表达程度与Met的浓度和作用时间密切相关。2.2奶牛乳腺上皮细胞SARS介导Met对酪蛋白生成和细胞状态的影响研究试验先采用RNAi干扰技术构建了奶牛乳腺上皮细胞SARS基因沉默模型,并研究了 SARS基因沉默介导Met对乳腺酪蛋白生成和乳腺细胞状态的影响。试验采用原代奶牛乳腺上皮细胞,培养至90%融合,先用饥饿培养基过夜培养12 h,使细胞处于同一分化状态。研究SARS基因沉默介导Met对SARS和各酪蛋白表达以及细胞活力和细胞周期的影响,分为4个处理,处理Ⅰ组缺失Met且无ⅢFBS 的培养基+NC(siRNAnegativecontrol),处理Ⅱ组含 0.6mMMet 且无 FBS的培养基+NC(siRNAnegativecontrol),处理Ⅲ组缺失Met且无FBS的培养基+ si-SARS,处理Ⅳ组含0.6mMMet且无FBS的培养基+si-SARS,各处理组培养基处理细胞6 h后,利用RT-PCR和免疫印迹法检测酪蛋白的表达变化,各处理组培养基处理细胞24h通过CCK-8方法和流式细胞法分别检测细胞活力和细胞周期的变化。结果发现,SARS基因沉默显著抑制了 SARS和4种酪蛋白的表达(P＜0.05);Met显著促进SARS的表达(P＜0.05);Met明显提高细胞活力、加快细胞周期进行、减缓细胞周期阻滞(P<0.05);在Met处理情况下,抑制SARS活性,细胞活力显著降低、细胞周期进行减慢、细胞周期阻滞增强,β-casein的表达量也显著减少(P<0.05)。以上结果提示,SARS可对Met发生明显响应,通过刺激Met对细胞活力和细胞周期进行速率的提高而促进细胞增殖。因此,SARS可作为重要信号分子,接收Met信号,通过增强细胞增殖进而促进乳腺酪蛋白合成过程。3 SARS与奶牛乳腺上皮细胞Met感应及转运互作对酪蛋白合成影响研究3.1奶牛乳腺上皮细胞Met转运载体研究试验研究了负责Met转运的可能的氨基酸载体。培养原代乳腺上皮细胞至90%融合,先用饥饿培养基过夜培养12h,使细胞处于同一分化状态,研究Met对不同氨基酸载体表达的影响,采用缺失和添加Met的培养基分别处理细胞6h,利用RT-PCR法和免疫印迹法检测氨基酸载体的表达变化;研究GPNA对ASCT2的表达影响,添加不同浓度GPNA(0、5、50、500和1000μM,其中0μM组为空白对照)处理细胞24 h,通过免疫印迹法检测ASCT2的蛋白表达变化;研究Met和GPNA对ASCT2和β-casein的表达影响,分为4个处理,处理Ⅰ组缺失Met培养基,处理Ⅱ组含0.6 mM Met培养基,处理Ⅲ组缺失Met培养基+500μM GPNA,处理Ⅳ组含0.6 mM Met培养基+500 μM GPNA,各培养基处理细胞6h,采用免疫印迹法检测ASCT2和β-casein的蛋白表达变化。结果发现,Met显著促进ASCT2蛋白的表达(P<0.05);GPNA明显抑制ASCT2的表达(P<0.05),且500 μM GPNA对ASCT2表达的抑制作用达到最强;Met明显促进ASCT2和β-casein的表达(P<0.05),GPNA明显抑制Met对ASCT2的促进表达(P<0.05),β-casein的表达也显著减少(P<0.05)。以上结果提示,Met主要由氨基酸载体ASCT2转运,且ASCT2可通过增强乳腺细胞对Met的摄取吸收而促进酪蛋白合成。3.2奶牛乳腺上皮细胞SARS与Met转运载体ASCT2的互作研究试验研究了奶牛乳腺上皮细胞SARS与Met转运载体ASCT2的互作关系。培养原代奶牛乳腺细胞至90%融合,先用饥饿培养基过夜培养12h,使细胞处于同一分化状态,研究Met和GPNA对SARS的表达影响,分为4个处理,处理Ⅰ组缺失Met培养基,处理Ⅱ组含0.6 mM Met培养基,处理Ⅲ组缺失Met培养基+500 μM GPNA,处理Ⅳ组含0.6 mM Met培养基+500 μM GPNA,各处理组培养基处理细胞6 h,采用免疫印迹法检测SARS的蛋白表达变化;研究SARS基因沉默介导Met对ASCT2的表达影响,利用RNA干扰技术抑制SARS表达活性,试验处理与试验2.2相同,各处理组培养基培养细胞6h,通过免疫印迹法检测ASCT2的表达变化;研究Met对奶牛乳腺细胞SARS与ASCT2间共定位的影响,采用缺失Met和添加0.6 mM Met的培养基处理细胞6 h,采用免疫荧光法检测二者间的共定位。结果发现,在Met缺失时,添加GPNA抑制了 ASCT2的转运表达,SARS蛋白表达丰度显著减少(P<0.05);Met缺失时,抑制SARS蛋白表达显著降低ASCT2的蛋白表达丰度(P<0.05);Met显著促进了 SARS与ASCT2蛋白间的共定位(P<0.05)。以上结果提示,SARS与ASCT2间存在一定的互作,且Met可一定程度促进这种互作。总之,SARS可作为重要信号分子,接收Met信号,通过加强与Met转运载体ASCT2间的互作进而促进乳腺细胞对Met的摄取吸收,最终增强乳腺酪蛋白合成过程。4 SARS介导Met在奶牛乳腺上皮细胞的利用机制研究4.1奶牛乳腺上皮细胞SARS介导Met对蛋白周转和酪蛋白生成的影响试验研究了 SARS介导Met对奶牛乳腺上皮细胞蛋白周转和酪蛋白生成的影响。培养原代奶牛乳腺上皮细胞至90%融合,先用饥饿培养基过夜培养12 h,使细胞处于同一分化状态,试验处理与试验2.2相同,对于蛋白周转研究,利用同位素示踪技术L-[ring-3H5]Phenylalanine,各培养基处理细胞第2天,添加同位素L-[ring-3H5]Phenylalanine孵育3 h,随后检测蛋白合成量和蛋白降解量;对于酪蛋白表达研究,各处理组培养基处理细胞6 h,利用RT-PCR和免疫印迹法进行检测。结果发现,Met显著提高了乳腺细胞内蛋白合成率和酪蛋白的表达量(P＜0.05),并明显降低了蛋白降解率(P＜0.05);SARS加强Met对蛋白周转和酪蛋白表达的促进作用(P＜0.05)。以上结果提示,在奶牛乳腺细胞中,Met明显促进了蛋白周转以及酪蛋白生成,SARS可增强Met的促蛋白周转和酪蛋白合成作用。4.2 SARS介导Met对奶牛乳腺酪蛋白合成相关信号通路的影响研究试验研究了 SARS介导Met对奶牛乳腺酪蛋白合成相关信号通路(mTOR、JAK2-STAT5和GCN2)的影响。培养原代奶牛乳腺上皮细胞至90%融合,先用饥饿培养基过夜培养12h,使细胞处于同一分化状态。试验处理与试验2.2相同,各处理组培养基处理细胞6h,利用RT-PCR和免疫印迹法检测这三条信号通路相关基因和蛋白的表达变化。结果发现,Met显著促进mTOR和JAK2-STAT5信号通路相关基因和蛋白以及相应磷酸化蛋白的表达(P<0.05),而明显抑制GCN2信号通路相关基因和蛋白以及相应磷酸化蛋白的表达(P<0.05);SARS显著加强Met对mTOR和JAK2-STAT5信号通路相关基因和蛋白表达的促进作用(P＜0.05)以及对GCN2信号通路相关基因和蛋白表达的抑制作用(P<0.05)。以上结果提示,SARS可加强Met进一步激活mTOR和JAK2-STAT5信号通路并抑制GCN2信号通路,从而促进乳腺酪蛋白合成。综上所述,SARS作为重要信号分子,可接收Met信号,促进奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成。其可能通过1)提高细胞活力和加快细胞周期进而促进细胞增殖;2)促进与Met转运载体ASCT2互作而增强乳腺细胞对Met的摄取吸收;3)激活mTOR和JAK2-STAT5信号通路并抑制GCN2信号通路,最终促进乳腺酪蛋白合成。