论文部分内容阅读
酸性蛋白酶是一类最适pH为2.5～5.0的天冬氨酸蛋白酶。真菌酸性蛋白酶能在低pH条件下，有效水解蛋白质，被广泛应用于酒精、酿酒、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业中，是酶制剂产业的一个重要产品，具有很好的商业开发价值。宇佐美曲霉(aspergillus usamii)是传统的酸性蛋白酶发酵生产菌，目前利用常规的育种方法提高其产量的潜力已经非常有限，通过基因工程技术培育工程菌是获得酸性蛋白酶高产菌株的有效途径。
黑曲霉是一种因其酶系丰富、代谢产物多而被广泛应用的工业生微生物。黑曲霉作为基因工程的受体菌有着与细菌、酵母不同的独特优点--具有很高的蛋白质分泌能力，一些糖化酶生产菌种在理想的培养条件下发酵分泌糖化酶的产率可达20g/L发酵液：能够正确进行各种翻译后加工，并且与高等真核生物类似；同时又是公认的安全生产菌株，发酵及后处理技术成熟。宇佐美曲霉与黑曲霉同为曲霉属，具有相同的基因表达调控机制。因此以黑曲霉糖化酶基因启动子调控宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因的表达，有望获得高效表达酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌，从而达到提高酸性蛋白酶产量和简化发酵条件的目的。
本研究以宇佐美曲霉(aspergillus usamii)为基因供体，通过重叠延伸PCR将宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉糖化酶基因的5’同源臂和3’同源臂进行拼接，构建pepA基因的表达框，使酸性蛋白酶基因受糖化酶启动子的调控。进一步构建黑曲霉表达载体，通过农杆菌介导法转化黑曲霉菌丝体，培育酸性蛋白酶工程菌。主要研究结果如下：
1.黑曲霉表达载体的构建
采用PCR扩增方法，分别获得宇佐美曲霉中的酸性蛋白酶基因pepA，黑曲霉糖化酶基因的上游片段GLA5和下游片段GLA3。运用重叠延伸PCR，将GLA5、GLA3与pepA基因拼接，得到酸性蛋白酶同源重组表达框GLA5-pepA-GLA3。构建农杆菌介导转化黑曲霉的表达载体pSZH-pepA，其T-DNA区顺向连接酸性蛋白酶基因和潮霉素基因两个同源重组表达框。
2.农杆菌介导的黑曲霉菌丝体遗传转化体系的建立与优化
从潮霉素B和头孢噻肟钠的筛选压力、乙酰丁香酮浓度、培养基的选择、黑曲霉菌龄、共培养时间以及共培养温度等方面，对农杆菌介导的黑曲霉菌丝体遗传转化体系进行摸索，最终确定以PDA作为共培养培养基，乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的条件下，用菌龄为5d的黑曲霉菌丝体与携带表达载体的农杆菌，在28℃恒温培养箱中静置共培养48h为最佳转化条件。
3.酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表达
以高产糖化酶的黑曲霉工业生产菌种为受体菌，采用根癌农杆菌介导法将表达载体pSZH-pepA转化黑曲霉菌丝体，经PCR鉴定，在69株稳定遗传的菌株中，共有37株为阳性菌株，其中3株为同源重组转化子。挑取稳定转化子于糖化酶糖化酶摇瓶发酵培养基中，34℃条件下300r/min培养3d。取培养液上清，经TCA法浓缩蛋白后，进行SDS-PAGE，得到约40Kda酸性蛋白酶条带，说明在糖化酶生产条件下，转入的酸性蛋白酶基因获得了表达。进一步对重组菌株的发酵液上清进行福林-酚法测定酶活，结果表明，酸性蛋白酶基因在黑曲霉中得到了表达，酶活最高达45.56U/mL，而在出发菌株中检测到的酸性蛋白酶酶活仅为3.72U/mL，说明转入的pepA基因已在糖化酶基因启动子调控下获得了表达。
4.黑曲霉重组菌株摇瓶发酵条件的优化
将重组菌株在不同条件下摇瓶发酵，探讨pH、培养温度、培养时间对产酶量的影响，确定适合重组菌摇瓶发酵的条件。结果表明，重组菌在初始pH为5.0，培养温度为34℃，培养时间为72h，产酶量较为理想。在此条件下，重组菌的发酵酶活可达45.56U/mL。