目的:采用改良的蛋白提纯法,从丁氏双鳍电鳐的电器官提纯乙酰胆碱受体蛋白(Ach R);选用提纯的Ach R蛋白采用二次免疫的方法复制实验性重症肌无力(EAMG)大鼠模型;动态观察EAMG大鼠行为学以及血清白细胞介素35(IL-35)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β1(TGF-β1)三种细胞炎性抑制性细胞因子水平的变化,探讨三种细胞因子参与EAMG发病的可能机制。方法:1.采用改良的亲和层析法,分别制备中华眼镜蛇和银环蛇毒神经毒素的亲和层析柱,从丁氏双鳍电鳐的电器官中提纯Ach R蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定获取的Ach R蛋白,BCA法测定两种神经毒素各自提纯蛋白的总量。2.取20只雌性6-8周Lewis大鼠,随机分为实验组、对照组。实验组使用提纯的Ach R+弗氏佐剂,采用零天初次免疫并在4周后二次免疫的方法免疫Lewis大鼠,对照组使用相同剂量的PBS+弗氏佐剂,初次免疫后进行如下检测:(1)分别采用肌无力评分、体重变化、新斯的明试验观察行为学变化。(2)大鼠发病后采集尾静脉血,提取血清检测乙酰胆碱受体抗体水平(Ach Rab)的水平明确大鼠免疫学变化。(3)每周采集尾静脉血,提取血清采用ELISA法测定血清IL-35、IL-10以及TGF-β1水平的变化。结果:(1)凝胶电泳后提纯蛋白在35KD-66.2 KD范围内可见四个条带,与文献相符,使用改良的方法成功提纯了Ach R蛋白。(2)使用中华眼镜蛇毒神经毒素层析柱平均每次可从30g左右电鳐电器官中提纯1.568±0.5235mg的Ach R蛋白,相同条件下银环蛇毒神经毒素提纯量为0.590±0.2847mg。使用中华眼镜蛇毒神经毒素层析柱提纯Ach R蛋白的效果更好(P<0.01)。(3)对照组大鼠均未见肌力异常。实验组10只大鼠,2只在实验过程中死亡,剩余8只大鼠在第二次免疫后出现肌无力症状并且症状逐渐加重,实验第八周EA MG大鼠肌无力评分明显高于对照组(P<0.01)。与对照组大鼠相比EAMG大鼠发病后体重下降(P<0.01);EAMG大鼠新斯的明试验为阳性。(4)实验第八周EAMG大鼠Ach R-ab水平较对照组高(P<0.01)。(5)免疫后1-5周EAMG大鼠与对照组大鼠IL-35水平无统计学差异(P>0.05);第6周EAMG大鼠IL-35水平呈升高趋势,第6、7、8周EAMG大鼠IL-35水平明显高于前5周EAMG大鼠和同时期对照组大鼠的IL-35水平高(P<0.01);对照组大鼠IL-35水平在各个时期未见明显变化(P>0.05)。(6)免疫后1-4周EAMG大鼠与对照组大鼠IL-10及TGF-β1水平无统计学差异(P>0.05);EAMG大鼠在4周后IL-10及TGF-β1水平开始下降,第5、6、7、8周EAMG大鼠IL-10及TGF-β1水平较前4周EAMG大鼠和同时期对照组大鼠的IL-10及TGF-β1水平明显降低(P<0.01);对照组IL-10及TGF-β1在各个时期无明显变化(P>0.05)。(7)EAMG大鼠肌无力症状与IL-10及TGF-β1水平呈负相关,与IL-35水平呈正相关(P<0.01)。结论:(1)采用改良的蛋白提取方法高效地从丁氏双鳍电鳐电器官中提纯足量的Ach R蛋白,使用中华眼镜蛇毒神经毒素具有更好的提纯效果。(2)使用改良方提纯的Ach R蛋白可成功复制Lewis大鼠的EAMG动物模型。(3)IL-35、IL-10及TGF-β1与EAMG大鼠的病情切相关。第二次免疫后大鼠IL-10及TGF-β1水平逐渐下降;EAMG大鼠发病后IL-35水平逐渐升高。