论文部分内容阅读
本研究旨在考察赭曲霉毒素A(OTA)对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2的毒害效应及抗氧化剂硒(亚硒酸钠来源)是否对OTA暴露下的细胞具有保护作用。研究共包括两个试验。试验一OTA对IPEC-J2细胞的生长及Nrf2介导的抗氧化系统的影响本试验在研究OTA暴露浓度和暴露时间对IPEC-J2细胞存活影响的基础上,进一步考察了OTA对细胞氧化还原平衡的影响及机理。首先,采用3×9因子设计,考察0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1、1.5、2μM／L的OTA处理IPEC-J2细胞12h、24h和48h,对细胞存活率的影响,每个处理6个重复。结果表明,OTA以时间-剂量依赖方式降低IPEC-J2细胞存活率,OTA浓度和处理时间均对细胞存活率产生极显著影响(P<0.01),且二者间存在极显著交互效应(P<0.01)。在上述结果的基础上,选用0、0.1、0.5和1μM／L的OTA与细胞共培养24h,考察OTA对IPEC-J2细胞结构功能完整性和氧化还原状态相关指标的影响,并初步探讨OTA对IPEC-J2细胞Nrf2活性的影响。研究结果显示：1、培养液LDH活性随OTA浓度增加呈线性或二次曲线增加(P<0.01),细胞Na+-K+-ATPase活性则呈线性或二次曲线降低(P<0.01)；2、细胞T-AOC和GSH含量、GPx、GST和GR酶活性均随OTA浓度增加而呈极显著的线性或二次曲线降低(P<0.01),培养液中MDA含量则呈极显著的线性或二次曲线增加(P<0.01)；OTA暴露对细胞SOD和CAT活性无显著影响；3、GSTA2、GSTO1、TrxR1、GR、GCLC和GCLM的mRNA相对表达量随OTA浓度增加呈极显著的线性或二次曲线降低(P<0.01),OTA对GPx2mRNA的表达无显著影响；4、随OTA浓度的增加,Nrf2活性呈先增加然后逐渐降低变化。上述结果表明,OTA以时间-剂量依赖方式对IPEC-J2细胞产生毒害作用,Nrf2介导的抗氧化防御系统的抑制是OTA毒性效应可能的机制。试验二硒(亚硒酸钠源)对OTA暴露下IPEC-J2细胞的保护效应试验研究了硒(亚硒酸钠源)对OTA诱导的IPEC-J2细胞氧化应激的保护效应,并进一步探讨了硒是否能激活Nrf2系统而发挥抗氧化作用。试验首先采用MTT法考察了OTA染毒和不染毒情况下,硒对IPEC-J2细胞存活和增殖的影响。结果表明,硒可以提高OTA暴露下的细胞存活率。然后考察了硒能否提高OTA染毒条件下细胞的抗氧化防御能力。试验共设4个处理,即先用0、4、8μM／L硒分别预处理细胞12h,再与OTA (1μM/L)共培养24h,分别表示为PBS/OTA组、SS4/OTA组、SS8/OTA组,其中PBS/OTA组为负对照组,同时另设一个未用OTA暴露的正对照组,即PBS／乙醇组。考察指标包括细胞培养液LDH活性、细胞Na+-K+-ATPase活性、细胞氧化还原状态以及抗氧化系统相关指标,并进一步检测抗氧化酶的mRNA表达水平。研究结果显示：1、与负对照组相比,硒预处理可显著降低OTA暴露细胞培养液中LDH的活性(P<0.05),提高细胞Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)；且8μM／L硒预处理对细胞的保护效果优于4μM／L硒预处理组；2、硒预处理能提高IPEC-J2细胞T-AOC,在8μM／L时达到显著水平(P<0.05)；与负对照组相比,硒预处理(SS4／OTA和SS8／OTA组)降低了MDA的含量,显著提高OTA暴露下细胞的GPx、GST、GR活性(P<0.05),对SOD活性有提高的趋势,但是GSH含量显著低于正和负对照组(P<0.05)；3、与负对照组相比,随培养基中硒浓度的提高(0、4、8μM/L), GCLC、GLCM、GPx2、GSTO1、GSTA2、TrxR1、GR的mRNA相对表达量均呈递增趋势,GCLC和TrxRl的mRNA表达水平甚至接近或超过正对照组。在上述结果的基础上,采用2×3因子设计,研究细胞经0、4、8μM／L硒(亚硒酸钠源)预处理12h后,替换含OTA (0、1μM)培养液攻毒培养24h对Nrf2的活化影响。结果表明,添加硒对缓解OTA导致的Nrf2活化抑制。综上所述,本试验结果发现OTA破坏了IPEC-J2细胞的氧化还原平衡,抑制Nrf2的活化从而抑制下游抗氧化基因的表达是毒性效应的可能机制。添加硒可以通过促进Nrf2的活化对IPEC-J2细胞产生保护效应。