第一部分异丙酚对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响目的探索新生大鼠海马神经前体细胞培养方法，并观察低浓度异丙酚对体外培养海马神经前体细胞增殖的影响。方法无菌获取新生大鼠海马神经前体细胞，在无血清含丝裂原刺激因子的细胞培养液中进行体外培养(DMEM／F12+2％B27添加剂+1％N2添加剂+20ng·mL^-1EGF+20ng·mL^-1bFGF)，利用免疫细胞化学的方法检测培养神经细胞神经上皮巢蛋白（Nestin）表达；将5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入细胞，观察其增殖特性；用去除丝裂原刺激因子的含血清细胞培养液诱导神经前体细胞分化，对神经元特异烯醇化酶（NSE）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达进行免疫细胞化学染色，观察其分化特性。将长势良好的第二代培养海马神经前体细胞种植于96孔板，培养24小时后加药处理。细胞分组如下（每组8孔）：正常对照组，细胞培养液中不加任何其它药物；异丙酚不同浓度处理组，细胞培养液中加入异丙酚，终浓度分别为0.5、2.5、12.5μmol·L^-1。脂肪乳对照组，细胞培养液中加入与异丙酚12.5μmol·L^-1中所含相同浓度的脂肪乳；药物处理72小时后，采用MTT法和³H-TdR掺入法观察异丙酚对细胞增殖的影响。结果从新生大鼠海马分离得到的细胞接种于含有表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）两种丝裂原刺激因子的无血清培养基中，可以持续分裂增殖并形成细胞克隆（神经球）。该神经球可以表达神经上皮干细胞蛋白（巢蛋白），同时也可以检测到外源性给予的细胞增殖特异性标记物（BrdU）。将EGF、bFGF从神经前体细胞培养基中撤除，神经前体细胞可以被诱导分化，分化后的细胞可以表达神经元特异性烯醇化酶或胶质纤维酸性蛋白。与脂肪乳对照相比，低浓度的异丙酚(0.5、2.5μmol·L^-1)处理组A_570nm值升高（P＜0.05），同时³H-TdR掺入值增加（P＜0.01）(异丙酚2.5μmol·L^-1组vs脂肪乳对照组：MTT法，A_570nmvalue 0.53±0.03vs0.49±0.03；³H-TdR掺入法，cpm value7884±309 vs 4849±659)。结论用此方法获取并培养的海马细胞具有神经前体细胞的特性，即具有增殖和多向分化潜能的能力。低浓度的异丙酚可以促进体外培养的海马神经前体细胞增殖。第二部分异丙酚促海马神经前体细胞增殖中信号通路的作用目的研究cAMP-PKA-CREB通路和Ras-Raf-MEK-ERK-CREB通路在异丙酚促海马神经前体细胞增殖过程中的作用。方法海马前体细胞培养及传代方法同前。1．H89对异丙酚促神经前体细胞增殖作用的影响：将第二代海马神经前体细胞种植到96孔板，培养24小时后用于实验。药物处理分组如下（每组8孔）：对照组（con，细胞培养液中不加任何药物），H89处理组(H89，细胞培养液中加入H89，其终浓度为10μmol·L^-1)，H89溶剂对照组（H_con，细胞培养液中加入H89溶剂，溶剂浓度同P98组中溶剂浓度），异丙酚处理组(P，细胞培养液中加入异丙酚，其终浓度为2.5μmol·L^-1)，异丙酚与H89共同处理组(P+H89，细胞培养液中同时加入异丙酚与H89，其终浓度分别为2.5μmol·L^-1和10μmol·L^-1)，以及异丙酚与H89溶剂共同处理组(P+H_con，细胞培养液中加入异丙酚与H89溶剂，异丙酚的终浓度为2.5μmol·L^-1，溶剂浓度同H89溶剂对照组)。2．PD98059对异丙酚促神经前体细胞增殖作用的影响：实验分组同H89（每组8孔）：对照组（con，细胞培养液中不加任何药物），P98059处理组(P98，细胞培养液中加入P98059，其终浓度为10μmol·L^-1)，P98059溶剂对照组（P98 con，细胞培养液中加入P98059溶剂，溶剂浓度同P98组中溶剂浓度），异丙酚处理组(P，细胞培养液中加入异丙酚，其终浓度为2.5μmol·L^-1)，异丙酚与P98059共同处理组(P+P98，细胞培养液中同时加入异丙酚与P98，其终浓度分别为2.5μmol·L^-1和10μmol·L^-1)，以及异丙酚与P98溶剂共同处理组(P+H con，细胞培养液中加入异丙酚与P98溶剂，异丙酚的终浓度为2.5μmol·L^-1，溶剂浓度同P98溶剂对照组)。药物处理72小时后，显微镜直接观察细胞形态学变化，并采用CCK试剂盒分析细胞增殖能力的变化。结果H89及PD98059(浓度均为10μmol·L^-1)处理体外培养的海马神经前体细胞，其增殖能力明显下降。CCK检测结果显示两者均可拮抗异丙酚的促增殖能力（P＜0.01）。结论异丙酚促体外培养海马神经前体细胞的增殖作用与cAMP-PKA-CREB通路和Ras-Raf-MEK-ERK-CREB通路相关。阻断这两条信号通道可以对抗异丙酚的促增殖作用。第三部分异丙酚对皮质酮抑制体外培养海马神经前体细胞增殖的影响及相关机制的研究目的研究静脉麻醉药异丙酚对皮质酮抑制体外培养大鼠海马神经前体细胞增殖作用的影响，以及这种作用与GABA_A受体之间的关系。方法1．将第二代海马神经前体细胞种植到96孔板，观察不同浓度皮质酮对细胞增殖的抑制作用，从而建立皮质酮抑制增殖的细胞模型。2．将第二代海马神经前体细胞种植于96孔板，24小时后按不同分组更换细胞培养液。分组如下（每组6孔，共10组）：1)对照组，细胞培养液中不加任何药物；2)异丙酚组Ⅰ，细胞培养液加入异丙酚，终浓度为0.5μmol·L^-1；3)异丙酚组Ⅱ，细胞培养液加入异丙酚，终浓度为2.5μmol·L^-1；4)皮质酮组，细胞培养液中加入皮质酮，终浓度为100μmol·L^-1；5)异丙酚与皮质酮合用组Ⅰ，细胞培养液中同时加入异丙酚和皮质酮，其终浓度分别为0.5μmol·L^-1和100μmol·L^-1；6)异丙酚与皮质酮合用组Ⅱ，细胞培养液中同时加入异丙酚和皮质酮，其终浓度分别为2.5μmol·L^-1和100μmol·L^-1；7)荷包牡丹碱组，细胞培养液中加入荷包牡丹碱，终浓度为10μmol·L^-1；8)荷包牡丹碱与皮质酮共同处理组，细胞培养液中同时加入荷包牡丹碱和皮质酮，终浓度分别为10μmol·L^-1和100μmol·L^-1；9)异丙酚、皮质酮、荷包牡丹碱共同处理组Ⅰ，细胞培养液中同时加入异丙酚、皮质酮与荷包牡丹碱，三者的终浓度分别为0.5、100、10μmol·L^-1。10)异丙酚、皮质酮、荷包牡丹碱共同处理组Ⅱ，细胞培养液中同时加入异丙酚、皮质酮与荷包牡丹碱，三者的终浓度分别为2.5、100、10μmol·L^-1。药物作用72小时后，采用MTT法和³H-TdR掺入法，观察异丙酚单独应用或与荷包牡丹碱同时应用时对皮质酮抑制细胞增殖的影响。3．利用免疫细胞化学的方法鉴定不同药物处理后海马前体细胞GABA_A受体的表达变化。将第二代海马神经前体细胞种植于96孔板，72小时后进行药物处理。细胞按如下分组（n=6）：正常对照组（细胞培养液中不加任何药物处理），阴性对照组（处理同正常对照组，实验分析时不加GABA_A受体α1亚基抗体），皮质酮100μmol·L^-1处理组，异丙酚0.5、2.5μmol·L^-1不同浓度处理组，以及异丙酚0.5、2.5μmol·L^-1分别与皮质酮100μmol·L^-1共同处理组。药物作用4小时后，利用细胞ELISA方法定量观察海马前体细胞表面GABA_A受体的变化。4．将第二代海马神经前体细胞种植于35mm细胞培养皿，24小时后进行药物处理。细胞按如下分组（n=3）：正常对照组（细胞培养液中不加任何药物处理），皮质酮100μmol·L^-1处理组，异丙酚2.5μmol·L^-1处理组，以及异丙酚2.5μmol·L^-1分别与皮质酮100μmol·L^-1共同处理组。药物作用4小时后，采用Western blot的方法进一步对细胞膜GABA_A受体蛋白表达进行定量分析。结果1．皮质酮可以剂量依赖性地抑制海马神经前体细胞增殖，本研究选取浓度为100μmol·L^-1的皮质酮建立其抑制增殖的细胞模型。2．与皮质酮处理组相比，异丙酚(0.5、2.5μmol·L^-1)与皮质酮合用可以明显提高培养细胞A_490nm值及³H-TdR掺入量（cpm值）（P＜0.05）。荷包牡丹碱则几乎完全拮抗异丙酚的作用（P＜0.05）。3．免疫细胞化学证实体外培养的海马神经前体细胞表达GABA_A受体。细胞ELISA定量结果表明，皮质酮100μmol·L^-1可以使海马神经前体细胞表面GABA_A受体表达下调（P＜0.05），异丙酚与细胞共培养后GABA_A受体表达增加，并可反转皮质酮下调GABA_A受体表达作用。4．Western blot结果显示，与正常对照组相比，异丙酚处理组可使GABA_A受体表达上调约16％，而皮质酮则使受体下调约14％。结论低浓度的异丙酚可以改善皮质酮所引起的体外培养大鼠海马前体细胞增殖的抑制作用。大鼠海马神经前体细胞膜表达GABA_A受体，异丙酚促增殖及逆转皮质酮抑制增殖作用与细胞表面GABA_A受体功能有关。第四部分异丙酚及皮质酮对体外培养海马前体细胞膜延迟整流钾离子通道影响的研究目的记录体外培养海马神经前体细胞外向型钾电流，并观察皮质酮及异丙酚对钾电流的影响。方法海马神经前体细胞培养方法同前。将第二代神经前体细胞球轻轻吹散后，种植到用1％多聚赖氨酸包被过的35mm培养皿中。细胞分组处理如下：对照组，皮质酮(100μmol·L^-1)处理组，异丙酚(2.5μmol·L^-1)处理组，以及异丙酚(2.5μmol·L^-1)与皮质酮(100μmol·L^-1)共同处理组。除对照组外，其余各组在细胞培养液中按要求加入相应浓度的药物。药物处理细胞24小时后，用于膜片钳检测海马神经前体细胞离子通道的电流。全细胞膜片钳记录电流时，钳制电压为-70mV，去极化刺激范围为-60～+70mV，以10mV递增，时程为50ms。结果 选取大小相似，圆形或两极稍有突触长起的神经前体细胞进行电流记录。与文献报道相似，神经前体细胞上，膜片钳检测不到钠离子电流。将电极内液中KCl换成CsCl，同时加入4-AP和TEA(10μmol·L^-1)后可以抑制所记录到的外向整流电流，证实所记录到的电流主要为外向型钾电流。此外向型钾电流具有明显的整流特性。皮质酮可以抑制外向型延迟整流钾离子通道，异丙酚则增强外向延迟整流钾离子电流。表现为皮质酮处理组最大钾电流降低，而异丙酚处理组最大钾电流增高，与对照组相比，具有显著性差异（P＜0.05）。同时，异丙酚可以反转皮质酮对延迟整流钾电流的抑制作用。结论 皮质酮、异丙酚与神经前体细胞共同培养24小时后，可以改变细胞延迟整流钾电流。延迟整流钾电流的改变可能是皮质酮、异丙酚影响神经前体细胞增殖的重要原因之一。