杆状病毒AcMNPV同源重复序列增强作用及同源重组率的研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wenshicai2009
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作为杆状病毒的公认模式种,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大小为134kb,已鉴定其拥有154个开放阅读框(ORFs)。在早期的研究中发现,它的基因组中存在多个大大小小不同的被称作同源重复序列(hrs)的结构,并且hrs已被证明了是可以作为病毒复制的起始点和转录的增强子,但hrs是否对杆状病毒的不同启动子具有广谱的增强作用还有待研究。杆状病毒表达系统(BEVS)在表达外源蛋白时常常是面临着杆状病毒的同源重组风险,这种产生的同源重组会增加实验结果的不确定性,而对实验结果产生干扰。我们将本研究划分为两个独立的部分,第一个部分是采用荧光显微镜、流式细胞术、RT-q PCR和Western blot相结合的方法检测同源重复序列(hr4a)对不同类型的病毒启动子的增强作用;第二个部分主要通过使用荧光显微镜、流式细胞术和绝对定量q PCR技术来进行探究降低杆状病毒同源重组率的策略。第一个部分,本研究选用五个不同时期的启动子:ie-1(立即早期),he65(延迟早期),gp64(早晚期),vp80、p6.9(晚期),p10(极晚期),构建了hr4a顺式连接不同启动子以及egfp作为报告基因的系列载体。同时,构建这些启动子分别顺式连接egfp的载体作为本底水平的对照组。将这些质粒分别与线性化的野生型的杆粒共同转染Sf9细胞,得到重组的杆状病毒。Sf9细胞接着被重组的杆状病毒感染,通过检测报告基因的表达量来探究hr4a对不同启动子的增强作用。结果表明hr4a只增强了早期的启动子,而对晚期启动子无增强作用。第二个部分,我们以杆状病毒的晚期基因(p10)编码区作为检测杆状病毒同源重组的同源片段,构建p10基因长度逐级减短和同源片段间隔引入点突变的系列质粒,并以红色荧光蛋白m Scarlet作为发生同源重组的报告基因。接着我们利用荧光显微镜、流式细胞术和绝对定量PCR技术来探究同源序列长度逐级减短和突变位点的规律引入是否会对重组率的高低产生影响。另一方面,我们将得到的重组病毒分别都进行了5次的传代,探究传代的过程中同源重组率是否有显著的变化。结果表明,大于40bp的同源序列具有相当高的同源重组的风险,同源重组率在5代间保持基本的稳定,并且同源序列长度逐级的减短和引入突变位点确实可有效的降低杆状病毒的同源重组率。根据如上所示,本文在杆状病毒AcMNPV的同源重复序列增强作用及同源重组率的两个方面进行了研究,这一方面证明了hr4a对晚期启动子没有增强作用;另一方面证明了杆状病毒的同源重组率可以通过缩短同源片段的长度和引入突变来得到降低。上述两个方面的结论,相信对BEVS的实际应用会具有指导意义,更大限度的实现BEVS的价值。
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