前言：　　 细胞生命活动的延续需要摄取各种物质,在这些物质的摄取过程中,细胞膜成了一道不可逾越的屏障。经典的跨膜扩散理论认为,O2,CO2,NH3和H2O这类非极性,小分子物质是通过单纯扩散方式通过细胞膜的,其转运方向由膜两侧的浓度差决定,不需要载体或通道蛋白的帮助。然而,有很多现象是单纯扩散理论无法解释的,比如细胞的缺血再灌注损伤。为什么细胞在氧浓度低的条件下没有因为缺氧而受损,却在氧浓度恢复时受到损伤?　　 上世纪80年代末水通道蛋白的发现推翻了水分子跨膜转运只能依靠单纯扩散的理论,这也让学者们意识到“气体分子是通过单纯扩散进行跨膜转运的”这一理论也许并不完全正确。人们对气体分子通道蛋白的寻找开始于对低等生物Mep和Amt转运体家族的研究。Nakhoul等发现Rh蛋白与Mep/Amt在结构上有大约20%的同源性,这种亲缘关系促使人们在人类红细胞中去寻找恒河猴血型(RhesusMacacusbloodgroup,Rh)蛋白的相似功能。有学者推测,在红细胞中Rh蛋白也具有类似的氨转运功能。然而目前并不清楚NH3和NH4+是否是Rh蛋白的特异性转运底物,而Rh蛋白是否为中性气体分子跨膜转运的非特异性通道也尚无明确结论。同时人们发现,绿藻中的Rh相似糖蛋白Rh1的表达是受CO2浓度调控的,这虽然不能直接说明Rh1蛋白对CO2具有转运功能,但对人类的Rh蛋白可能具有CO2跨膜转运功能做出了推测。近年来有学者指出,红细胞膜上的Rh蛋白可能在碳酸酐酶Ⅱ(carbonicanhydraseⅡ,CAⅡ)附近形成CO2通道,而Rh蛋白位于带3蛋白周围,故带3蛋白复合体可能同Rh蛋白一起参与了CO2气体的跨膜转运。近期另有研究发现Rh相关糖蛋白(Rhassociatedglycoprotein,RhAG)可能参与CO2转运,通过比较发现大约50%的CO2转运是由RhAG完成的,而相似的转运量由水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)介导。细胞膜对CO2的通透性在NH4Cl存在时受到抑制,且呈剂量依赖性,说明CO2和NH4Cl可能是通过同一通道进行转运的,并且彼此之间存在竞争性抑制。　　 在细胞的生命活动中要消耗大量的氧,以此来提供代谢所需的能量,而细胞能量代谢过程中所需的氧来源于细胞外液,因此,当细胞外液氧浓度变化时,细胞生命活动的能量来源随之发生变化,作为生命活动承担者的蛋白质(尤其是与细胞外液直接接触的细胞膜蛋白)自然也会随着环境的不同而发生变化,使细胞最大程度地适应新的环境。尤其是当细胞外液的氧浓度降低时,细胞代谢的能量来源减少,这必然促使细胞加大对氧的摄取,以保证其正常的生命活动。在此过程中,氧会尽可能多的通过细胞膜进入细胞内,而细胞膜蛋白质表达的变化对这一过程的顺利完成起到了至关重要的作用,同时蛋白质表达的改变也使得细胞的代谢发生了变化,从而进一步适应氧浓度变化给细胞生命活动带来的改变。　　 通过我们之前的氧通量实验研究发现,气体分子并不像传统理论解释的那样,完全依靠单纯扩散来进行跨膜转运,而是还存在载体蛋白参与的易化扩散,若能寻找到参与跨膜转运的蛋白质则对解决细胞生命活动的相关问题意义重大。　　 材料与方法：　　 1、材料　　 健康雄性C57小鼠,体重20-25g,均由中国医科大学实验动物中心提供。健康成人红细胞悬液(B型,RhD阳性;B型,RhD阴性),由辽宁省血液中心提供。RhD阳性、阴性红细胞的RhC、c、E、e均为阳性。　　 2、方法　　 本实验采用seglen两步法灌流肝脏,获取新鲜离体的小鼠肝脏细胞,并应用自制的氧通量测定装置,测定并分析不同溶解氧浓度下离体小鼠肝细胞、人类红细胞及不同抑制剂孵育后的人类红细胞的跨膜氧转运情况;采用westernblot技术检测红细胞RhD和AE1在不同氧浓度下的差异表达;应用双向电泳及质谱技术检测肝细胞膜蛋白在不同氧浓度下的差异表达。　　 3、统计学分析　　 用SPSS13.0软件对氧通量实验数据及westernblot条带灰度值进行统计学处理,应用Imagemaster5.0软件对样品蛋白点之间量变变化情况进行分析,标记出表达量差异明显的蛋白点,数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,p＜0.05表示差异有统计学意义。　　 结果：　　 1、肝细胞氧通量实验中,通过量和氧通量曲线的峰值位于中氧浓度;而通过率和通量率的曲线则是随初始氧浓度升高而降低的。　　 2、红细胞氧通量实验中,通过量和氧通量曲线随初始氧浓度升高而升高,超过中氧浓度后趋于饱和状态;而通过率和通量率曲线的峰值位于中氧浓度。　　 3、4,4-二异硫代硫酸盐-2,2-二苯乙烯二磺酸盐(4,4-diisothiocyano-2,2-stilbenedisulfonate,DIDS)孵育后发现氧通量实验的各项指标均下降,说明阴离子交换蛋白1(anionexchanger1,AE1)可能参与红细胞跨膜氧转运,且DIDS的抑制位点可能就是氧的转运位点。　　 4、RhD阴性红细胞氧通量实验的各项指标均低于RhD阳性红细胞,说明RhD蛋白可能参与红细胞跨膜氧转运。　　 5、低氧浓度下表达量大于高氧浓度的肝细胞膜蛋白质可能包括:载脂蛋白E前体,NADH-细胞色素B5还原酶,溴结构域包含蛋白8,核被膜蛋白2,过氧化物酶体膜蛋白11C,血清白蛋白前体,锌指蛋白亚型2,波形蛋白,氨基甲酰磷酸合成酶,血清转铁蛋白前体,磷酸丙糖异构酶,腺苷酸激酶同工酶4以及一个未命名的蛋白质。　　 结论：　　 1、肝细胞和红细胞的跨膜氧转运可能是膜蛋白参与的易化扩散。　　 2、AE1和RhD蛋白可能参与红细胞的跨膜氧转运活动。　　 3、载脂蛋白E前体,NADH-细胞色素B5还原酶,溴结构域包含蛋白8,核被膜蛋白2,磷酸载体蛋白,过氧化物酶体膜蛋白11C,血清白蛋白前体,锌指蛋白亚型2,波形蛋白,氨基甲酰磷酸合成酶,血清转铁蛋白前体,磷酸丙糖异构酶,腺苷酸激酶同工酶4以及一个未命名的蛋白质可能与氧的跨膜转运有关,是我们下一步实验的重点。