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目的:应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并通过体外实验,观察VEGF受抑制后,结肠癌细胞凋亡情况的变化,为RNA干扰技术的临床应用奠定基础。方法:(1)将VEGF基因mRNA作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抑制VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体。(2)体外实验中,将上述载体转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR、免疫荧光、Northern blot和Western blot观察VEGF表达受抑的程度;通过Tunel、电镜和流式细胞计数的方法,观察VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率的变化。结果:(1)成功构建了两种抗VEGF的shRNA表达载体,测序证实序列正确。(2)体外实验中,通过RT-PCR、免疫荧光、Northern blot和Western blot,发现这两种抗VEGF表达载体,在胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,但在不同的细胞系中,其抑制效率不同;Tunel、电镜和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。结论:(1)针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度有明显差别,提示RNA干扰作用存在明显的细胞系选择性。(2)Tunel、电镜和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。