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第一部分BMSCs对老龄小鼠卵母细胞体外成熟及质量的影响目的 观察BMSCs对老龄小鼠卵母细胞成熟及质量的影响。方法 收集老龄小鼠GV期卵母细胞,和BMSCs在transwell小室内体外共培养,相同条件下未处理的老龄小鼠卵母细胞为老龄组,未处理的年轻小鼠卵母细胞为年轻组。通过观察IVM 16h后第一极体的排出评估其成熟率,观察IVF 24h后二细胞形成率评估其受精率,利用免疫荧光染色观察MⅡ期卵母细胞纺锤体形态来评估卵母细胞质量。结果 卵母细胞体外培养16h及体外受精24h的结果显示,共培养组(74.4%)卵母细胞IVM 16h后第一极体排出率显著高于老龄组(57.0%)(P<0.01),但仍比年轻组低(82.8%)(P<0.01);共培养组(77.9%)卵母细胞IVF 24h后二细胞形成率同样显著高于老龄组(60.4%)(P<0.01),但仍比年轻组低(87.6%)(P<0.01)。老龄组卵母细胞纺锤体形态微管排列紊乱,纺锤体不能正常极化,分开的同源染色体没有随第一极体排出;共培养组及年轻组纺锤体呈两端逐渐变细的纺锤形,极化至卵母细胞皮质部。共培养组卵母细胞纺锤体异常率(32.89%±2.15%)显著低于老龄组(49.73%±2.36%),但高于年轻组(21.00%±3.70%)(P<0.01)。结论 共培养组的卵母细胞与老龄组相比,其成熟率及受精率显著升高,表明BMSCs共培养后显著影响卵母细胞体外成熟及质量;和BMSCs共培养后纺锤体形态及染色体分布异常率明显下降,表明BMSCs对卵母细胞减数分裂起到改善作用,说明BMSCs可以改善老龄小鼠卵母细胞体外成熟及质量。第二部分BMSCs改善老龄卵母细胞成熟和质量的机制研究目的 观察BMSCs对老龄小鼠卵母细胞Mfn2表达和线粒体功能的影响,初步明确BMSCs改善卵母细胞成熟和质量的作用机制。方法 收集老龄小鼠GV期卵母细胞,和BMSCs在transwell小室内体外共培养,相同条件下未处理的老龄小鼠卵母细胞为老龄组,未处理的年轻小鼠卵母细胞为年轻组。通过Q-PCR及Western Blot检测卵母细胞Mfn2 mRNA和蛋白质的表达情况。用Q-PCR检测线粒体基因组ND1基因的相对表达量来确定卵母细胞中mtDNA的拷贝数。通过JC-1染色检测体外培养16h后卵母细胞线粒体膜电位,通过mito-tracker green绿色荧光探针检测卵母细胞线粒体的分布情况。结果 共培养组卵母细胞Mfn2 mRNA及蛋白表达均显著高于老龄组(P<0.01),但仍低于年轻组(P<0.01);共培养组卵母细胞mtDNA拷贝数同样显著高于老龄组(P<0.01),低于年轻组(P<0.01)。共培养组卵母细胞线粒体膜电位显著高于老龄组,差异有统计学意义(P<0.01)。观察卵母细胞内线粒体分布情况,老龄组线粒体分布异常呈簇状、团块状分布于卵母细胞胞质内。BMSCs与卵母细胞共培养后,改善其线粒体的分布,共培养组(56.54%)异常率相对于老龄组(73.67%)显著降低(P<0.01),但高于年轻组(23.13%)(P<0.01)。结论 共培养组Mfn2 mRNA及蛋白表达显著增高,mtDNA拷贝数及线粒体膜电位均显著高于老龄组,共培养组卵母细胞线粒体分布向均匀化分布变化,线粒体分布异常率显著下降,说明BMSCs可能通过激活Mfn2的表达,调节老龄化卵母细胞的线粒体结构及功能,从而改善老龄小鼠卵母细胞发育及质量。