金黄色葡萄球菌（金葡菌）广泛存在于自然界以及人和动物的皮肤和腔道粘膜表面,可导致多种畜禽的皮肤软组织感染以及乳腺炎、肺炎和菌血症等疾病,是一种严重危害畜禽养殖和人类健康的革兰氏阳性机会致病菌。目前,抗生素耐药性是治疗金葡菌感染最大的挑战,耐药性金葡菌,尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）已成为引起动物感染以及经食物链传播的主要耐药病原菌。另一方面,我国畜禽养殖业进入“限抗”和“减抗”时代,金葡菌感染防治更加棘手。虽然近年来抗体、噬菌体溶素、疫苗、抗菌肽等抗生素替代策略在各项试验中取得了积极的进展,但临床尚无新药问世,因此亟待开发新型抗金葡菌感染策略和药物。金葡菌可分泌多种毒力因子介导机体损伤和免疫逃避,从而成功建立感染。其中α-毒素是几乎所有金葡菌都分泌的成孔性毒力因子,在宿主细胞受体解整合素和金属蛋白酶10（ADAM10）的介导下形成孔状复合物,导致宿主细胞裂解并激活多个细胞事件,在金葡菌肺炎、皮肤感染、败血症等疾病中发挥重要致病作用。金葡菌侵入机体后被宿主固有免疫分子识别并激活下游炎症信号通路,TLR2是其中发挥中心作用的模式识别受体,识别金葡菌后将细胞质衔接子My D88募集到TIR受体结构域,通过核因子κB（NF-κB）的核易位和MAPK的激活诱导炎症反应。炎症反应是机体重要的防御机制,一方面可以促进机体对病原菌或其他外来刺激的清除,同时也能够促进受损组织的修复和再生。如果过弱,会导致机体无法成功抵御感染。然而当炎症反应在持续时间或强度上失控时,过度的炎症反应将严重阻碍细菌的清除和组织稳态的恢复,甚至会引发组织损伤。因此,基于细菌靶向的α-毒素和机体靶向的TLR2信号通路是抗金葡菌感染的重要潜在靶标。中药在畜禽养殖业感染性疾病防治中广泛应用,是畜禽饲料添加剂“禁抗”后的首选,其活性成分也是“替抗”新药研发先导化合物发现的重要来源。综上,本研究以金葡菌α-毒素和宿主细胞TLR2信号通路为靶点在天然化合物中开展了双靶点抑制剂研究;体外组织细胞感染模型和体内实验动物感染模型验证候选化合物抗金葡菌感染作用;分子生物学相关试验和TLR2敲除小鼠感染试验等进一步揭示候选化合物靶向α-毒素和TLR2抗金葡菌感染的双重作用机制。在本实验室构建的中药单体库中,我们成功筛选获得到了多种活性抑制剂,其中杨梅素、积雪草酸、矢车菊素等能有效抑制α-毒素的成孔活性;异乌药内酯,山奈酚和肉桂醛等可显著抑制由TLR2激动剂诱导的TNF-α产生;而穗花杉双黄酮、甘草查尔酮对上述两个靶标均具有较好的抑制作用,并以穗花杉双黄酮效果为佳。4μg/ml穗花杉双黄酮即可完全抑制α-毒素溶血活性,其IC50值为2.326μg/ml。进一步研究发现穗花杉双黄酮在受试范围内不影响金葡菌的生长和α-毒素的表达,提示穗花杉双黄酮对金葡菌的生长压力和基因选择性较弱。体外细胞感染试验分析发现穗花杉双黄酮可有效抑制α-毒素介导的裂解性细胞死亡及金葡菌的胞内存活。此外,穗花杉双黄酮通过抑制α-毒素减少金葡菌生物被膜形成。同时,穗花杉双黄酮阻断TLR2和My D88互作从而抑制下游NF-κB和MAPK炎症信号通路的激活,有效降低金葡菌感染过程中由TLR2介导的炎症反应。重要的是,穗花杉双黄酮对多种TLR2配体（Pam3CSK4、Pam2CSK4和金葡菌磷壁酸（LTA））介导的炎性反应均呈现剂量依赖性抑制作用,也可有效抑制其他热灭活革兰氏阳性菌（肺炎链球菌和单核细胞增生李斯特菌）对TLR2炎症信号通路的激活作用,但对热灭活大肠杆菌则无,提示穗花杉双黄酮具有抗革兰氏阳性细菌感染及其他与TLR2相关疾病的应用潜力。我们进一步验证了穗花杉双黄酮对野生型小鼠和TLR2缺陷小鼠金葡菌肺炎的体内治疗作用,结果发现穗花杉双黄酮有效缓解肺脏的病理性损伤,降低肺脏炎症因子的水平,从而显著提高野生型小鼠的存活率;而在TLR2缺陷小鼠模型中,穗花杉双黄酮则无显著的治疗作用。虽然穗花杉双黄酮并不能有效减轻TLR2缺陷小鼠的肺部炎症水平,提高小鼠存活率,但与体外试验结果相一致,穗花杉双黄酮能明显减轻小鼠肺组织出血症状,这一缓解作用可能归因于其对α-毒素的活性抑制作用。上述结果进一步在体内水平阐明了穗花杉双黄酮靶向α-毒素和TLR2所介导炎性反应抗金葡菌感染的作用及机制。综上,本论文发现天然黄酮类化合物穗花杉双黄酮是一种有效的金葡菌α-毒素和宿主TLR2信号通路双重抑制剂,在对金葡菌没有生长压力的情况下,可以特异性地阻止α-毒素孔的形成而有效抑制由其介导的致病机制,并通过阻断TLR2与My D88之间的相互作用限制TLR2介导的炎症反应。我们的研究表明同时抑制细菌关键毒力因子和机体重要炎症反应通路以削弱金葡菌致病力和宿主过度炎症反应对宿主的不利影响是一种潜在的抗细菌治疗策略,为基于抗毒力和抗炎的双靶标抗金葡菌感染策略新药研发提供了先导化合物。