目的通过构建干燥综合征（sj（?）gren’s syndrome，SS）患者唇腺组纵cDNA差减文库，筛选SS患者唇腺中异常表达的基因，从中选择若干可能与SS发病机制相关的基因作为研究对象，从mRNA水平、蛋白质水平进行研究，并结合临床检验指标进行分析，初步探讨这些基因在疾病发生、发展中的作用。研究对象唇腺组织全部来自2004年9月～2006年4月间在北京协和医院口腔粘膜科接受唇腺活检的患者。分原发SS和正常对照两组，原发SS的入选标准要符合2002年SS国际分类（诊断）标准，除外同时合并其它结缔组织病的患者。对照组选择标准是：有口干或眼干主诉，但SFR和眼科滤纸实验检测均正常，自身抗体阴性，唇腺病理正常，同时除外合并其它基础病变。另外还包括部分唇腺囊肿患者或下唇外伤的患者，收集病变组织周围或清创组织中的正常唇腺作为研究材料，除外伴发其它全身疾病的患者。两实验组间的年龄比较经统计学检验无显著性差异。所有参与本实验的患者在进行唇腺活检前均被告知，活检取出的唇腺除送病理科行常规检查外，还将有部分唇腺样本用于SS发病机制的基础研究，获得研究对象同意后留取唇腺活检的部分标本用于本次研究。详细记录参与本实验患者的临床资料，包括年龄、性别、SFR、腮腺造影、滤纸实验、泪膜破裂时间、角膜染色、ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体、RF、免疫球蛋白（Ig）、ESR、唇腺活检病理等。方法1．SS唇腺组织中cDNA差减文库的构建：利用TRIR（Total RNA IsolationReagent，ABgene）分别提取SS和正常对照唇腺中总RNA，利用差减PCR试剂盒(Clontech PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit，Clontech)进行差减杂交，将杂交产物转入载体，构建正、反两个差减文库。2．异常表达基因的筛选：随机挑选768个克隆与核素([α-³²P]-dATP)标记的PCR第二轮产物进行杂交，进行Northern blot验证，选择杂交信号Ratio值大于2的克隆进行测序，所用引物为SP6和T7（Sequenase V2．OKit，UK），在ABI377测序仪（美国Perkin-Elmer公司产品）单向测序，将得到的序列在www.ncbi.nlm.nih.gov网上进行比对，得到GeneBank号和基因名称等有关信息，查阅文献，选择与SS发病可能有关的基因做为研究的目标基因。3．目标基因的mRNA定量分析：根据目标基因的序列设计特异性引物，同时合成内参基因的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物电泳后扫胶进行半定量分析。4．蛋白质表达的免疫组化分析：用中性福尔马林固定，石蜡包埋的唇腺切片做底物，用山羊抗人MUC5B亲合纯化多克隆抗体（Santa Cruz）进行免疫组化染色，使用Image-Pro plus5.0病理图像分析软件测定视野内棕色颗粒沉积的累计光密度，以此代表蛋白表达量。5．观测结果建立Excel数据库，使用SPSS11.0（Statistics Pakage for Social Science）软件进行统计分析，比较SS组和正常对照组间的差异，将目标基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平与临床检验结果进行相关性分析，P小于0.05认为具有统计学意义。结果1．SS组和正常对照组患者年龄比较，经过t检验，p＞0.05，没有统计学差异，说明这两组人群在年龄方面存在可比性。2．成功构建SS唇腺cDNA的差减文库，随机挑选768个克隆，经Northern blot验证Ratio值大于2的有99个克隆，其中上调51个，下调48个，经过测序得到63个200-700bp的序列片断，上网比对，与GenBank已收录的基因符合率在98％以上。3．经过半定量PCR分析，MUC5B和MUC7基因在两组间的表达存在显著性差异，t值分别为2.4和2.3，P值分别0.032和0.021，说明这两个基因在SS患者唇腺中表达明显低于正常对照。4．MUC5B和MUC7 mRNA的表达量分别与病程、SFR、Igγ％、ESR、RF、唇腺中淋巴细胞浸润灶评分（LFS）、抗SSA抗体滴度进行相关分析，发现SS患者唇腺中这两个基因表达量与LFS和抗SSA抗体滴度呈显著负相关，MISC5B与这两个因素的Pearson相关系数分别为-0.387和-0.474，P值分别为0.032和0.013；MUC7与这两个因素的Pearson相关系数分别为-0.386和-0.595，P值分别为0.032和0.001。多元回归分析证实这两个基因表达量只与抗SSA抗体滴度相关，MUC5B和MUC7的回归系数分别为-0.714和-0.708，P值分别为0.001。5．MUC5B免疫组化分析：MUC5B主要分布在腺泡细胞上，导管细胞少量着色，说明该蛋白主要由腺泡细胞表达。SS患者唇腺中MUC5B蛋白的表达明显低于正常对照。6．MUC5B蛋白表达量分别与病程、SFR、球蛋白γ％、ESR、RF、唇腺中LFS、抗SSA抗体滴度进行相关分析，发现SS患者唇腺中蛋白表达量与LFS、抗SSA抗体滴度呈显著负相关，与MUC5B mRNA表达量呈正相关，Pearson相关系数分别为-0.3396，-0.546和0.750，P值分别为0.041，0.003和0.000。多元回归分析证实只有MUC5B mRNA表达水平与蛋白表达水平相关，回归系数别113.664，P值为0.000。结论1．抑制性差减杂交方法可用于风湿病发病机制的研究，是初步高通量筛选异常表达基因的用力手段。2．成功构建了SS患者唇腺cDNA差减文库，SS患者唇腺中存在异常表达的基因。利用差减文库筛选出来的基因部分可能与SS发病相关，可以作为目标基因进一步研究。3．MUC5B和MUC7mRNA的表达在SS患者唇腺组织中是明显低于正常对照。与疾病的活动性无关，主要与抗SSA抗体滴度相关，提示自身抗体在其中起主要作用。4．MUC5B和MUC7的基因表达的变化同步，影响表达变化的因素相同，提示可能是同一机制导致两种基因表达的变化。5．MUC5B蛋白表达与LFS和抗SSA抗体滴度呈负相关，与MUC5B基因表达呈正相关，多元回归分析显示MUC5B基因表达降低是MUC5B蛋白表达下降的主要因素。