杀鲑气单胞菌检测方法的建立及抗菌药物筛选

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杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是引起鲑鳟鱼类感染疖疮病的主要病原菌,给鲑鳟鱼类养殖造成严重的经济损失。该病原菌的传统检测方法受到时间和地点的限制,建立一种新型快速、方便的杀鲑气单胞菌现场检测方法,在感染早期对该病原菌进行检测对水产养殖业的发展具有重要意义。重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术是在2006年首次被报道的一种新型的、可在25~45℃的恒温下实现扩增的核酸扩增技术,对设备依赖性小,操作简单、快速。本研究针对杀鲑气单胞菌,根据杀鲑气单胞菌的铁载受体(fst A)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于RPA与侧向流试纸条相结合(Lateral Flow Strips,RPA-LFS)的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法,可在37℃孵育25 min特异性检测杀鲑气单胞菌,对其他致病菌无交叉反应;灵敏度试验结果显示检测该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为1 CFU/反应。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,操作简单,结果可通过肉眼观察,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业杀鲑气单胞菌的现场检测,对杀鲑气单胞菌感染的现场快速诊断具有广泛应用前景。针对杀鲑气单胞菌的治疗目前主要依赖抗生素,但长期使用已出现耐药性问题。中药在我国有着悠久的历史,很多中药具有消炎抗菌的作用,中药具有多组分和多靶点的特点,在长期临床应用中不易产生耐药性。因此,从中草药中寻找新型抗菌药物、利用中药解决抗生素耐药替代疗法已成为解决细菌耐药性的有效途径。目前,关于中药抗菌的报道也越来越多,但针对杀鲑气单胞菌的中药抗菌药物尚未有报道。本研究选择了具有解毒消炎作用的蒲公英、具有清热解毒作用的金银花,分别对这两中药的水提物、醇提物进行了抗杀鲑气单胞菌的体外活性测试,旨在筛选出具有抗杀鲑气单胞菌的中药提取物以及中药组合物,以便为开发出更好的中药抗菌新药奠定基础。研究结果显示:金银花、蒲公英两种中药醇提物抑菌效果显著,最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值均为6.25 mg/m L,仅蒲公英水提物对杀鲑气单胞菌生长具有抑制作用,MIC结果为50 mg/m L,初步确定了其应用可行性。进一步用高效液相色谱法分析其有效成分,确定了金银花和蒲公英提取液的主要成分为绿原酸、咖啡酸和异绿原酸等有机酸类物质,表明中药中的有机酸具有较强的抑菌活性。本研究的结果对杀鲑气单胞菌的中药抗菌治疗具有重要意义。该论文有图9幅,表19个,参考文献93篇。
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