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喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤,占喉癌的95%以上。目前LSCC的治疗手段主要是手术联合放疗及化疗,尽管早期的LSCC患者可以通过手术或辅助疗法达到治愈,但临床上大于半数的患者在诊断时已处于进展期,5年总生存率低于50%,因此迫切需要寻找LSCC发生和进展的分子生物学标志及探索其分子生物学机制。环状RNA(circular RNA,circ RNA)因其具有首尾共价结合的环状结构而命名,在多种疾病如肿瘤的发生、进展中发挥着重要的调控作用。大量研究证实,环状RNA通过吸附相应的mi RNA调节其下游基因的表达。因其稳定性高,存在组织及疾病特异性,有望成为疾病诊治的潜在生物学标志物。本研究首先检测了LSCC组织和癌旁组织及LSCC细胞株中circ FLNA表达情况,同时分析circ FLNA的表达与LSCC患者淋巴结转移的关系;并在此基础上通过体外实验探讨circ FLNA参与了LSCC细胞迁移的分子生物学机制。第一部分circ FLNA在喉鳞状细胞癌中的表达水平目的:探讨circ FLNA在喉鳞状细胞癌中的表达及意义。方法:1.收集LSCC和对应癌旁组织、体外常规培养的LSCC细胞和正常鳞状上皮细胞,提取RNA,q RT-PCR方法检测LSCC组织及细胞株中circ FLNA的表达。2.分析circ FLNA的表达与LSCC患者临床病理参数的关系。结果:1.喉鳞状细胞癌组织中circ FLNA存在不同程度的表达设计并合成了针对circ FLNA连接处的反向引物进行PCR,而PCR模板分别是互补DNA(c DNA)和基因组DNA(g DNA),扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,结果显示,circ FLNA连接处的片段只能以c DNA为模板扩增出来,而以g DNA为模板不能扩增出来circ FLNA连接处的片段。用RNase R处理LSCC组织后,q RT-PCR结果发现,RNase R处理组线性FLNA的表达较对照组降低87%,而circ FLNA降低36%。2.circ FLNA在喉鳞状细胞癌组织和细胞株中表达均明显升高q RT-PCR结果显示,circ FLNA在LSCC组织中表达明显高于癌旁组织,且在LSCC细胞株SCC-2和Hep2细胞的表达也明显升高。3.circ FLNA在喉鳞状细胞癌组织中的表达与淋巴结转移相关分析39例LSCC组织中circ FLNA的表达与临床病理参数的关系,结果显示,circ FLNA在LSCC组织中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、分化程度、是否吸烟、饮酒均无显著相关性,但与淋巴结转移呈正相关,转移组表达明显高于非转移组。小结:circ FLNA在喉鳞状细胞癌组织及细胞中表达升高,且与喉鳞状细胞癌淋巴结转移密切相关。第二部分circ FLNA表达上调与喉鳞状细胞癌迁移的关系目的:探讨circ FLNA是否参与了喉鳞状细胞癌的迁移及可能机制。方法:1.构建circ FLNA的过表达载体pc DNA3.1-circ FLNA或敲低质粒sh-circ FLNA并转染至LSCC细胞,Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力。2.Western blot检测LSCC细胞敲低或过表达circ FLNA后FLNA、MMP-2及MLK1蛋白表达水平。3.q RT-PCR检测LSCC细胞敲低或过表达circ FLNA后FLNA m RNA的表达变化。4.构建线性FLNA敲低质粒,将其单独转染或与circ FLNA过表达载体共同转染Hep2细胞,Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力。结果:1.上调喉鳞状细胞癌细胞中circ FLNA的表达,能够促进喉鳞状细胞癌细胞的迁移与转染阴性对照组相比,Hep2及SCC-2细胞转染pc-DNA3.1-circ FLNA后能明显增加细胞中circ FLNA的表达;且Hep2及SCC-2细胞的迁移能力明显升高。2.敲低喉鳞状细胞癌细胞中circ FLNA的表达,能够抑制喉鳞状细胞癌细胞的迁移Transwell小室迁移实验显示,敲低Hep2及SCC-2细胞中circ FLNA的表达,能明显抑制细胞的迁移能力。3.circ FLNA通过上调FLNA表达促进喉鳞状细胞癌细胞迁移Western blot结果显示,在Hep2细胞中过表达circ FLNA能显著上调迁移标志基因FLNA及MMP-2蛋白表达,而敲低circ FLNA能明显下调FLNA、MMP-2蛋白表达,但均不能影响Hep2细胞中MLK1蛋白的表达。另外,敲低Hep2细胞中FLNA表达能明显抑制细胞的迁移,而同时过表达circ FLNA和敲低FLNA后,与单纯过表达circ FLNA组相比,Hep2细胞迁移能力降低。q RT-PCR结果显示,无论敲低或者过表达circ FLNA,均不能改变线性FLNA的m RNA水平。小结:1.circ FLNA的表达上调参与了喉鳞状细胞癌细胞的迁移。2.circ FLNA通过上调FLNA蛋白表达促进喉鳞状细胞癌细胞的迁移。第三部分circ FLNA通过吸附mi R-486-3p参与喉鳞状细胞癌的迁移目的:进一步探讨circ FLNA是否通过海绵吸附mi R-486-3p参与喉鳞状细胞癌细胞的迁移。方法:1.RNA22,mi Randa及RNAhybrid预测与circ FLNA相互作用的mi RNA。2.常规培养人LSCC细胞株Hep-2细胞,荧光素酶报告基因及oligo-pull down、q RT-PCR检测circ FLNA及mi R-486-3p之间的关系。3.Targetscan软件预测,并以Hep2细胞为研究对象,双荧光素酶报告基因、Western blot验证FLNA是否是mi R-486-3p的靶基因。4.收集上述LSCC组织和细胞株,q RT-PCR方法检测LSCC组织及细胞株中FLNA的表达,并分析喉鳞癌组织中FLNA表达与淋巴结转移的关系。5.查阅TCGA数据库,分析FLNA与LSCC患者预后关系。6.分别将sh FLNA、mi R-486-3p模拟物转染至Hep2细胞,或将二者共同转染至Hep2细胞;或将pc DNA3.1-circ FLNA及mi R-486-3p模拟物分别转染或共同转染至Hep2细胞,Western blot检测相关蛋白表达;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。结果:1.circ FLNA作为分子海绵吸附mi R-486-3p从而上调喉鳞状细胞癌细胞中FLNA蛋白表达通过RNA22,mi Randa及RNAhybrid网站的预测及综合分析,预测的可以和circ FLNA有吸附位点的RNA共有12个,即mi R-34a-5p,mi R-92b-5p,mi R-296-3p,mi R-486-3p,mi R-661,mi R-574-5p,mi R-760,mi R-762,mi R-1226-5p,mi R-1271-3p,mi R-1275,mi R-1287-5p。LSCC细胞中转染circ FLNA特异探针后进行oligo-pulldown,q RT-PCR结果显示,mi R-486-3p、mi R-547和mi R-1275-5p能够明显被富集。荧光素酶报告基因结果显示,mi R-486-3p模拟物能够显著抑制pmir GLO-circ FLNA荧光素酶活性,但mi R-547和mi R-1275-5p模拟物对pmir GLO-circ FLNA的荧光素酶活性没有影响。2.在喉鳞状细胞癌细胞中,FLNA是mi R-486-3p的靶基因Targetscan发现在FLNA基因3’UTR中存在着mi R-486-3p的结合位点。荧光素酶报告基因结果所示,转染mi R-486-3p模拟物后,含有FLNA野生型3’UTR组的荧光活性明显下降,而mi R-486-3p模拟物几乎对突变组的荧光素酶活性无影响。Western blot结果显示,与对照组相比,过表达mi R-486-3p能够明显下调Hep2细胞中FLNA蛋白表达,而敲低mi R-486-3p则上调Hep2细胞中FLNA蛋白的表达。3.circ FLNA/mi R-486-3p/FLNA通路调节喉鳞状细胞癌细胞的迁移分别将sh FLNA,mi R-486-3p模拟物转染至LSCC细胞,或将二者共同转染至Hep2细胞,Western blot结果表明,当sh FLNA及mi R-486-3p模拟物共同转染Hep2细胞后,与单独转染组相比,MMP-2及FLNA的蛋白明显降低。Transwell迁移实验也表明,在Hep2细胞中敲低FLNA同时过表达mi R-486-3p能增强mi R-486-3p过表达对细胞迁移的抑制作用。相反,将pc DNA3.1-circ FLNA及mi R-486-3p模拟物分别或共同转染至Hep2细胞,Western blot结果显示,共转染可部分逆转过表达circ FLNA所导致的MMP-2和FLNA蛋白表达的增加。Transwell迁移实验也证实,Hep2细胞中过表达circ FLNA能显著促进细胞迁移,并逆转了由mi R-486-3p过表达对细胞迁移的抑制作用。4.FLNA在喉鳞状细胞癌组织中表达升高,高表达FLNA与喉鳞状细胞癌预后不良相关q RT-PCR结果显示,FLNA在LSCC组织和细胞株表达升高,且在伴有淋巴结转移的LSCC组织中表达更高。另外TCGA数据库分析发现,高表达FLNA的LSCC患者总体预后不良。小结:1.circ FLNA在喉鳞状细胞癌细胞中表达上调,通过靶向mi R-486-3p/FLNA轴,介导喉鳞状细胞癌细胞的迁移。2.FLNA在喉鳞状细胞癌组织中表达上调,且与淋巴结转移密切相关结论:1.circ FLNA在喉鳞状细胞癌中表达上调,且高表达的circ FLNA与淋巴结转移相关。2.circ FLNA表达上调促进喉鳞状细胞癌的迁移。3.circ FLNA通过吸附mi R-486-3p进而影响FLNA蛋白表达参与喉鳞状细胞癌的迁移。