研究背景:缺氧是心血管疾病最常见的病理生理改变,长期慢性低氧不仅存在于高海拔地区,而且也常见于紫绀型先天性心脏病和慢性缺血性心脏病(chronic ischemia heart disease,CIHD)。既往流行病学证据显示长期居住在高海拔地区的人群有较少的CIHD发生率及更低的心脏疾病死亡率。一些动物实验研究也表明,慢性间断缺氧的心肌能更好的耐受急性缺血/缺氧损害。此外,长期临床观察也发现,某些紫绀型先心病患儿虽然心脏长期被低氧的血液灌注,但在一定时期内仍能存活,且很少发生心力衰竭,并能抵御心脏外科手术所致的缺血缺氧损害。上述现象表明长期慢性低氧可能诱导了心肌内在的适应性变化,且这种变化对心肌具有保护作用。然而,产生这种保护作用的机制尚不完全清楚,因此,深入研究慢些缺氧诱导心肌保护的分子机制将有益于提高心肌保护策略,改善心脏外科手术围术期缺血缺氧所致心肌损害的治疗水平。低氧可导致细胞内质网应激,从而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。活化的转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是一个由670个氨基酸组成的内质网膜II型跨膜蛋白质,在维持细胞稳态中起着关键作用。ATF6在反应内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)时被裂解成具有活性的转录因子并转移至细胞核,活化一系列内质网应激反应基因从而发挥作用。最新研究表明在慢性应激时,ATF6具有促进内质网功能恢复并保护细胞免受慢性应激损害,可见ATF6具有细胞保护及促细胞生存的特性。前期我们研究发现在紫绀型先心病患儿心肌组织ATF6持续活化,提示其可能在慢性缺氧心肌细胞内发挥着维持自我适应及保护作用。但是,其潜在保护作用及确切机制有待于进一步研究。大量研究已阐明Akt,亦称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)在维持心肌细胞生存和心肌保护中的重要性。最近研究也发现慢性缺氧诱导了心肌细胞Akt的表达并参与了减轻心肌细胞缺血缺氧/复氧损伤的保护机制。UPR和Akt通路长期以来被认为在特殊条件下具有调节和影响细胞命运的功能,但是作为UPR反应分支之一的ATF6与Akt通路在功能上的联系仅在最近才有所报道。然而,Akt是否涉及ATF6参与的慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注(ischemia/reperfusion,i/r)损伤尚未见报道。因而,需要进一步的实验研究来阐明。研究意义:本研究拟构建慢性缺氧刺激的动物模型,检测慢性缺氧心肌atf6的表达情况;通过在体和离体动物实验来验证慢性缺氧刺激对心肌耐受急性i/r损伤的效果,进一步从细胞水平探讨atf6在慢性缺氧增加心肌耐受急性i/r损伤中的作用,并采用sirna技术阐明atf6可能通过调控akt信号通路而发挥这种作用。研究内容:1.构建慢性缺氧刺激的动物模型并检测atf6在慢性缺氧心肌的表达。实验以健康雄性sprague-dawley(sd)大鼠为研究对象,建立慢性缺氧动物模型。将sd大鼠随机分为两组:常氧组和慢性缺氧组。常氧组大鼠在常氧环境(78%n2、21%o2)下喂养,缺氧组大鼠在模拟海拔5000米小动物低压低氧舱内喂养(舱内大气压404mmhg、氧分压84.98mmhg、温度25℃)。4周后,获取大鼠,检测大鼠体重及心脏重量、血氧指标、血红蛋白浓度及红细胞比积来评估缺氧程度。采用免疫荧光染色及westernblot技术检测缺氧心肌组织atf6及其下游基因grp78/bip的表达情况。2.研究慢性缺氧刺激对心肌耐受急性i/r损伤的效果。建立心肌急性i/r模型。通过结扎左冠状动脉前降支建立在体急性心肌i/r损伤模型,超声测量两组大鼠缺血前和再灌注24h后心功能变化、检测血液心肌酶学指标变化以及ttc染色了解心肌坏死程度来评估慢性缺氧对心肌耐受急性i/r损伤的影响;以langendorff灌流系统建立离体心脏急性i/r损伤模型,监测两组大鼠缺血前和再灌注后左心室内压力变化、检测灌流液ldh活性以及ttc染色了解心肌坏死程度来研究慢性缺氧在促心肌耐受急性i/r损伤中的作用。3.探讨atf6在增加慢性缺氧心肌耐受急性i/r中的作用及可能机制。利用h9c2心肌细胞株,建立慢性低氧细胞模型。将h9c2心肌细胞在氧浓度为13%o2的培养箱内分别培养0h、12h、24h、48h、72h,采用westernblot技术检测上述5个不同时间点缺氧对心肌细胞内atf6、grp78/bip及akt/p-akt表达的影响。建立i/r细胞模型,h9c2细胞分为常氧和低氧培养两组,培养48h(即缺氧诱导atf6表达最高时间点)后,将两组h9c2细胞置于模拟的缺血培养液培养1h后转移到常规培养条件下培养3h,cck-8细胞计数法检测细胞活性了解细胞存活状态,检测释放到培养基的ldh活性了解细胞坏死程度以评估缺氧对心肌细胞耐受急性i/r损伤的影响。采用sirna技术,将sirna质粒转染到h9c2细胞在常氧和低氧条件下培养48h后给予细胞模拟i/r处理,检测细胞活性和培养基ldh活性来说明atf6在增加慢性缺氧耐受急性i/r损伤的作用;检测细胞grp78/bip及akt/p-akt的表达变化,说明atf6发挥此种作用的可能机制。研究结果:1.实验前两组大鼠体重无统计学差异,经过4周缺氧暴露,慢性缺氧组大鼠体重、血氧分压及氧饱和度明显低于常氧组,而心脏重量、血红蛋白水平、红细胞比积及心脏重/体重则明显高于常氧组,差异具有统计学意义。2.在体大鼠急性i/r模型中,尽管慢性缺氧导致心脏收缩功能有所下降,表现为缺血前低氧组大鼠ef及fs低于常氧组,分别给予两组大鼠缺血30min随之再灌注24h处理后,两组大鼠心脏收缩功能均下降,但缺氧组ef及fs下降程度较常氧组小,且高于常氧组;再灌注24h后血清ck-mb活性低于常氧组,心肌梗塞面积小于常氧组,表明缺血前慢性缺氧处理能较好地保留i/r后心脏收缩功能,减少心肌损害。3.langendorff离体心脏灌流模型中,在缺血前慢性缺氧组心脏较常氧组心脏lvdp要低,但经30min缺血随后再灌注的10min、20min、30min、40min、50min及60min各个时间点lvdp在缺氧组要明显高于常氧组;再灌注60min后测定灌流液ldh活性及心肌梗塞面积均小于常氧组,差异具有统计学意义。表明缺血前慢性缺氧处理能促进再灌注后心功能恢复,降低心肌i/r损害。4.westernblot检测慢性缺氧组大鼠心肌组织活化型atf6α(50kda)表达显著高于常氧组,而且缺氧组左室及右室心肌组织中atf6α的表达无差异,免疫荧光检测也显示了低氧左室及右室心肌组织atf6α的表达显著增加。h9c2心肌细胞低氧培养0h、12h、24h、48h、72h,结果发现atf6α于缺氧24h开始表达上调,与0h比较差异有统计学意义,而且随着缺氧时间的延长,其表达量也逐渐增加。westernblot检测grp78/bip在心肌组织和h9c2心肌细胞的表达与atf6α呈相同趋势变化。5.中度低氧培养诱导了心肌细胞atf6表达增加,采用sirna-atf6质粒抑制atf6表达后,低氧不能诱导atf6α表达上调,选择atf6α高表达时间点给予h9c2心肌细胞模拟缺血1h后再灌注3h处理,检测心肌细胞活力及培养基ldh活性,结果发现低氧培养的心肌细胞在模拟缺血1h后再灌注3h其活力较常氧培养的心肌细胞要高,而ldh活性则低于常氧处理组。然而,利用sirna干扰atf6表达后同样地给予细胞模拟i/r,则出现相反结果,即低氧培养的心肌细胞活力较常氧培养的心肌细胞要低,ldh活性高于常氧处理组。结果表明,长时间低氧处理可以增加心肌细胞耐受随后的急性i/r损伤,而且是atf6参与了这种保护作用。6.为了阐明ATF6参与慢性缺氧增加心肌细胞耐受急性I/R损伤的可能机制,我们检测了Akt信号通路。发现中度低氧诱导了H9c2心肌细胞p-Akt表达上调,其表达变化规律与ATF6及Bip一致,利用si RNA干扰ATF6表达并低氧诱导48h后检测p-Akt结果发现其表达被抑制。结果表明,ATF6参与慢性缺氧增加心肌耐受急性I/R损伤的分子机制可能涉及到Akt信号通路。结论1、本研究成功构建了慢性缺氧大鼠模型。通过对大鼠体重、心脏重量、心脏重/体重、血氧指标、血红蛋白浓度及红细胞比积等生理参数变化来评估低氧程度,发现该模型比较符合紫绀型先心病的长期慢性缺氧特点,因此可将此模型用于紫绀型先心病缺氧相关的基础研究。2、慢性缺氧诱导了大鼠心肌组织及H9c2心肌细胞ATF6α及下游基因GRP78/Bip的表达上调,在低氧培养的H9c2心肌细胞中随着缺氧时间延长二者表达也逐渐增加。3、在体大鼠急性I/R模型中,慢性缺氧能较好地保留大鼠心脏急性I/R后的心肌收缩功能,减少了心肌损害;Langendorff离体心脏灌流模型中,慢性缺氧预处理能促进大鼠心脏I/R后心功能恢复。慢性缺氧有助于增加心肌对急性I/R损伤的耐受。4、慢性缺氧增加了H9c2心肌细胞耐受急性I/R损伤,ATF6参与了长时间慢性低氧诱导的这种心肌保护作用。5、慢性低氧培养诱导了H9c2心肌细胞p-Akt蛋白表达上调,采用si RNA干扰ATF6α表达后低氧培养不能诱导H9c2心肌细胞p-Akt表达,且低氧培养的心肌细胞对急性I/R损伤耐受性降低。ATF6在发挥慢性缺氧适应增加心肌耐受急性I/R损伤中的保护效应可能是通过Akt通路实现的。