论文部分内容阅读
目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS),是一种以选择性侵害脑和脊髓运动神经元为特征的慢性致死性神经变性疾病,临床表现为肌萎缩,肌强直,无力等,最终导致呼吸衰竭而死亡。虽然临床病程长短各异,但多在诊断后的3-5年死亡。ALS的发病机制主要涉及氧化应激、谷氨酸兴奋毒性、蛋白质异常聚积、线粒体功能异常、基因突变、神经营养因子的缺乏以及细胞凋亡等。最近,在ALS和伴有泛素阳性包涵体的额颞叶痴呆病人[frontotemporal lobar dementia with ubiquitin-positive inclusions,(FTLD-U)]的脑中发现了含TDP-43的泛素化的包涵体,TDP-43在神经变性疾病中受到越来越多的人的关注。TDP-43是由1号染色体上的TARDBP基因编码的普遍存在的核蛋白,具有414个氨基酸,相对分子质量为43000。它的作用包括:特异性前RNA的剪切、转录,信使RNA的稳定性以及小RNA的生物发生等。至今,已发现40多种TDP-43的显性突变基因存在于散发和遗传性的ALS病人中,TDP-43的发现为我们研究ALS和FTLD-U的发病机制开拓了新的视野。TDP-25是病理性TDP-43异常泛素化产生的C-末端片段,混杂在胞浆的不可溶性聚集体中,并通过获得性毒性损伤神经元,诱导细胞死亡,在疾病病理过程中发挥着重要作用。成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9,FGF9)是成纤维细胞生长因子家族中的一员,在机体各组织中广泛分布,具有促细胞增殖、分化、生长和存活的作用,在个体胚胎发育和成年后的多种生物学过程中发挥重要作用。其在中枢神经系统中强大的促增殖和细胞保护作用受到越来越多的关注。大量研究表明FGF9具有促进多种神经细胞生殖、存活,调节胞内抗氧化损伤防御系统、降低氧化损伤时神经元的死亡,上调乙酰胆碱转移酶活性,营养细胞等多种作用。已有研究发现FGF9存在于运动神经元中,并对运动神经元有营养保护作用,但是在ALS疾病中的疗效却鲜有报道。本实验以稳定转染TDP-25的NSC-34细胞系作为ALS细胞模型,研究FGF9对细胞的影响及可能涉及的机制,从而探讨FGF9是否对TDP-25诱导的细胞毒性有保护作用。方法:本研究中使用稳定转染TDP-25的NSC-34细胞系作为ALS细胞模型。首先通过western免疫印迹技术检测稳定转染TDP-25的NSC-34细胞内TDP-25质粒的表达情况;用不同浓度的FGF9处理该细胞24 h后,通过CCK-8试剂盒检测其对细胞活力的影响,用LDH试剂盒检测其对细胞损伤的作用;选用适合浓度干预细胞后,用western免疫印迹技术检测抗氧化酶HO-1、GSS及凋亡蛋白caspase-3的水平。结果:1 TDP-25致病质粒在稳定转染TDP-25的NSC-34细胞和正常NSC-34细胞中的表达情况在稳定转染TDP-25的NSC-34细胞中检测到TDP-25质粒的表达,其表达水平约为内源性TDP-43表达水平的2倍(2.615±0.1796 VS 1.252±0.04943)。正常NSC-34细胞中检测到内源性TDP-43的表达水平与稳定转染TDP-25的NSC-34细胞系中相近,没有统计学差异(1.25±0.05 VS 1.16±0.14),但却没有检测到TDP-25的表达。2 FGF9对稳定转染TDP-25的NSC-34细胞细胞活力的影响应用不同浓度(0-200μM)的FGF9处理稳定转染TDP-25的NSC-34细胞24 h后,在0-1μΜ和10-200μΜ的FGF9对于细胞活力没有明显区别,在2-5μM之间的FGF9依据药物浓度逐渐增大,细胞活力逐渐增加(114±2.54 VS 100±0.91,p<0.05;122.3±2.79 VS 100±0.91,p﹤0.05)。3 FGF9对稳定转染TDP-25的NSC-34细胞损伤释放LDH水平的影响应用不同浓度(0-200μM)的FGF9处理稳定转染TDP-25的NSC-34细胞24 h后,在0-1μΜ和10-200μΜ的FGF9对于细胞向外释放LDH水平没有明显区别,在2-5μM之间的FGF9依据药物浓度逐渐增大,LDH水平逐渐降低(269.4±18.7 VS 357.2±8.59,p<0.05;210.9±34.54 VS 357.2±8.59,p<0.05)。4 FGF9对稳定转染TDP-25的NSC-34细胞内HO-1和GSS蛋白水平的影响应用不同浓度(2、5μM)的FGF9处理稳定转染TDP-25的NSC-34细胞24 h后,免疫蛋白印迹检测结果表明,与未处理组相比,FGF9处理组细胞内HO-1蛋白的表达水平明显减低,且5μM FGF9处理组中细胞内HO-1蛋白水平明显低于2μM处理组(1.25±0.09 VS 1.95±0.45,p<0.05;0.62±0.04 VS 1.95±0.45,p<0.05);GSS蛋白水平在不同FGF9浓度作用下均明显高于未处理组,但2μM FGF9处理组与5μM处理组细胞内GSS蛋白水平未发现显著差异(0.75±0.21 VS 0.41±0.14,p<0.05;0.92±0.06VS 0.41±0.14,p<0.05)。5 FGF9对稳定转染TDP-25的NSC-34细胞内caspase-3和c-caspase-3蛋白的影响应用不同浓度(2、5μM)的FGF9处理稳定转染TDP-25的NSC-34细胞24 h后,western检测结果表明,与未处理组相比,FGF9处理组细胞内caspase-3蛋白的表达水平明显增加,但2μM FGF9处理组与5μM处理组细胞内caspase-3蛋白水平未发现显著差异(1.46±0.12 VS 1.17±0.02,P<0.05;1.64±0.11 VS 1.17±0.02,P<0.05);c-caspase-3蛋白水平在不同FGF9浓度作用下均明显低于未处理组,但2μM FGF9处理组与5μM处理组细胞内c-caspase-3蛋白水平未发现显著差异(0.77±0.01 VS 0.91±0.06,p<0.05;0.70±0.03 VS 0.91±0.06,p<0.05)。结论:1低剂量的FGF9可以明显增加稳定转染TDP-25的NSC-34细胞的细胞活力,促进细胞增殖。2低剂量的FGF9可以明显降低稳定转染TDP-25的NSC-34细胞的细胞内LDH水平,对细胞有保护作用。3低剂量的FGF9可能是通过降低细胞内氧化应激水平,抑制细胞凋亡来发挥对稳定转染TDP-25的NSC-34细胞的保护作用的。