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哺乳动物卵泡发育是一个复杂而受到精细调控的过程,从原始卵泡（primordial follicle,PF）激活到成功排卵,并伴随着卵泡闭锁和退化等过程。在卵泡发育的过程中,颗粒细胞（granulosa cell,GC）的形态和功能会不断改变,并为卵母细胞的成熟和排出提供保障。而颗粒细胞的异常凋亡或者增殖障碍都会阻碍卵泡的正常发育,甚至造成卵泡过度丢失,这些结果直接导致卵母细胞质量下降并缩短雌性动物的生殖寿命。课题组前期通过对太湖猪和大白猪排卵前卵泡组织进行转录组测序（RNA测序和小RNA测序）,筛选得到差异表达的前病毒插入序列2（proviral integration site 2,Pim2）基因和miR-135a,在此研究基础上,我们探究其在小鼠卵泡发育中的功能。主要研究结果如下:1.Pim2基因在颗粒细胞凋亡和卵泡发育过程中的作用（1）通过对C57BL/6小鼠腹腔注射PIM2激酶抑制剂SMI-16a,成功构建PIM2激酶抑制型小鼠模型。检测其卵巢重和体重发现:与对照组小鼠相比,4周龄PIM2激酶抑制型小鼠卵巢重与体重比值下降了23%。通过ELISA检测血清激素水平,结果显示卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone,LH）水平显著升高,而雌激素水平显著下降。通过H&E染色发现,相比对照组小鼠,PIM2激酶抑制型小鼠的原始卵泡数目下降了43%,而次级卵泡数目升高了69%,早期有腔卵泡和有腔卵泡的数目也明显降低。通过Ki67和TUNEL染色,发现抑制PIM2激酶活性会造成小鼠卵巢中TUNEL阳性GCs比例显著升高,以及Ki67阳性GCs的减少。以上结果表明,PIM2激酶抑制型小鼠的卵泡发育受阻,并且表现出一系列与人类卵巢功能不足（premature ovarian insufficiency,POI）相关的表型。（2）通过Western blot、流式细胞术、CCK-8和免疫荧光发现,Pim2基因可以抑制小鼠颗粒细胞（murine granulosa cell,m GC）凋亡,并促进其增殖,进而保证m GC的正常存活。RT-q PCR和ELISA发现,Pim2基因能够上调激素合成和卵泡发育相关基因的表达水平,并且促进m GCs合成雌激素。随后,通过定点突变试验成功构建了激酶活性丧失的突变型PimK61A超表达质粒,并证明了PimK61A在m GCs中不再发挥抗凋亡、促增殖以及增强雌激素合成的功能。（3）对Pim2敲降（Pim2-KD）和对照组m GCs进行磷酸化蛋白组定量分析发现,与对照组m GCs相比,Pim2-KD m GCs中鉴定到81个磷酸化水平上调蛋白的87个磷酸化位点（差异倍数大于1.3,p值小于0.05）,以及260个下调磷酸化蛋白上的425个磷酸化位点（差异倍数小于0.77,p值小于0.05）。其中Pim2-KD m GCs中有大量下调差异表达的磷酸化蛋白被富集到了“positive regulation of apoptotic process”（GO:0043065）过程,而上调的磷酸化蛋白主要被富集到了“steroid biosynthetic process”（GO:0006694）和“steroid metabolic process”（GO:0008202）过程。以上结果证明了PIM2介导的磷酸化与m GC凋亡、类固醇激素合成密切相关。（4）通过定量磷酸化蛋白组和蛋白质免疫沉淀质谱测序联合分析发现,死亡相关蛋白激酶3（death-associated protein kinase 3,DAPK3）是PIM2激酶的潜在底物蛋白。蛋白质免疫沉淀试验证明了PIM2可以磷酸化DAPK3上第306位的丝氨酸残基,而SMI-16a能够抑制PIM2介导的磷酸化作用。通过共聚焦免疫荧光和Western blot发现,超表达Pim2基因能够促进DAPK3WT定位在颗粒细胞的细胞质中,而磷酸化位点失效的突变型DAPK3S306A不受Pim2基因的影响,可以进入并聚集于细胞核中。随后,蛋白质免疫沉淀试验验证了DAPK3可以结合并磷酸化p53,而PIM2可以抑制两者之间的相互作用。以上结果证明,PIM2可以磷酸化DAPK3,使其无法入核,从而导致DAPK3无法促进p53对下游凋亡相关基因的转录调控。（5）构建小鼠Pim2基因启动子区的缺失片段p GL3载体,通过荧光活性分析发现在m GCs和中国仓鼠卵巢K1（CHO-K1）细胞中Pim2启动子序列在-247bp～-104bp之间存在关键转录因子结合位点,进一步运用BIOBASE软件筛选到转录因子POU2F1的两个结合位点（-162bp～-148bp,-127bp～-113bp）。定点突变和Ch IP-q PCR试验验证了Pim2启动子序列上存在转录因子POU2F1的结合位点。超表达Pou2f1能够促进Pim2的表达,而敲降Pou2f1会抑制Pim2的表达,并且POU2F1能够通过上调Pim2表达而促进m GC的存活。2.miR-135a在卵泡发育过程中对颗粒细胞的生长作用（1）通过流式细胞术、Western blot、CCK-8和免疫荧光试验发现miR-135a可以调控颗粒细胞G1期的进程,提高G1/S比例并抑制m GC增殖,同时miR-135a还可促进m GC凋亡。双荧光素酶报告系统验证了miR-135a可以靶向转化生长因子β受体1（TGF-beta receptor type 1,Tgfbr1）和G1/S特异周期蛋白D2（G1/S-specific cyclin-D2,Ccnd2）的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）,RT-q PCR和Western blot证明了miR-135a可以抑制Tgfbr1和Ccnd2基因m RNA和蛋白的表达。（2）通过流式细胞术、Western blot、CCK-8和免疫荧光试验证明了Tgfbr1基因可以促进颗粒细胞G1期进程,并提高m GC增殖活性、抑制m GC凋亡。同时,miR-135a可以抑制Tgfbr1和Ccnd2介导的m GC增殖过程。（3）通过免疫荧光、共聚焦试验发现超表达Tgfbr1能够上调SMAD3的磷酸化表达,并促进SMAD3定位到细胞核中;相反,超表达miR-135a能够降低SMAD3的磷酸化水平,抑制SMAD3的核内定位。通过染色质免疫共沉淀、RT-q PCR和Western blot发现超表达Tgfbr1可以提高Ccnd2基因的转录水平并促进其m RNA和蛋白的表达。（4）构建小鼠miR-135a基因启动子区的缺失片段p GL3载体,通过双荧光素酶报告系统发现在m GCs中,miR-135a启动子序列在-250bp～-100bp之间存在关键转录因子结合位点,进一步运用BIOBASE软件筛选到转录因子ESR2的两个结合位点（-197bp～-183bp,-141bp～-127bp）。定点突变和Ch IP-q PCR试验验证了ESR2能够结合到miR-135a基因的启动子序列上。超表达ESR2可以抑制miR-135a的表达,并且雌激素同样会抑制m GCs中miR-135a的表达水平。