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目的:在临床上,浅表型非浸润膀胱癌(Nonmuscle-invasive bladder cancer,NMIBC)经常采用手术切除后结合膀胱内化疗灌洗的方法进行治疗。然而,膀胱癌中带有多药耐药性的肿瘤生成细胞(Tumor-repopulating cells,TRCs)无法被药物清除,最终导致膀胱癌的复发和耐药。肿瘤细胞来源的囊泡(tumor cell-derived microparticles,T-MPs)是肿瘤细胞受到外界刺激而发生凋亡时候,细胞会发生程序性死亡而改变细胞骨架结构,向外界释放一类100～1000nm直径的,由细胞膜结构包裹内容物的囊性小泡。前期的研究已经表明,通过肿瘤来源的囊泡包裹化疗药物可以增强多种肿瘤的治疗效果,并且囊泡因为其特有的脂筏结构具有极好的理化稳定性,在肿瘤治疗上有着极大的应用前景。但囊泡作为一种优秀的治疗载体,有限的载药量限制了囊泡的应用,并且囊泡在肿瘤细胞中的代谢与增效机制尚未阐明。在此基础上,本研究将在此基础上,探讨肿瘤来源的囊泡作为一种化疗增敏剂结合化疗药物对浅表型非浸润膀胱癌进行治疗,并研究囊泡在肿瘤细胞内的代谢,阐明囊泡化疗增敏的机制,为临床膀胱癌治疗提供一种新的治疗策略。方法:(1)为了检测肿瘤来源的囊泡是否能够对化疗药物治疗浅表型非浸润膀胱癌治疗有增强作用,我们建立了小鼠原位浅表型非浸润膀胱癌模型。并且提取了不同肿瘤来源的囊泡检测对化疗药物治疗荷瘤小鼠是否有增敏作用;并且对小鼠肿瘤进行H&E染色进行分析;(2)为了检测肿瘤来源的囊泡对肿瘤治疗的增敏作用是否由免疫因素介导,我们采用了免疫缺陷的裸鼠以及巨噬细胞清除小鼠进行原位膀胱癌建模,并用肿瘤来源的囊泡检测是否对化疗药物有增敏作用;(3)为检测肿瘤来源的囊泡是否能够通过增强化疗药物直接杀伤肿瘤细胞,我们检测了囊泡作为增敏剂是否增强化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡,我们用流式细胞仪检测处理过后的肿瘤细胞表面的Annexin-V和7-AAD染色检测细胞早凋和晚凋比例;(4)为了检测肿瘤来源的囊泡能够增强肿瘤细胞对药物的摄取和抑制肿瘤细胞对药物的外排,我们用流式细胞仪和液相色谱检测囊泡处理过的肿瘤细胞对药物的摄取和外排;(5)为了检测肿瘤来源的囊泡对肿瘤细胞的多药耐药蛋白的表达影响,我们通过实时定量PCR和western blot检测了囊泡处理过后的肿瘤细胞的ABCB1基因和P-gp蛋白的表达;(6)为了检测溶酶体在肿瘤来源囊泡对肿瘤细胞增敏中的作用,我们用siRNA技术将溶酶体生成相关基因TFEB敲低;(7)为了检测肿瘤细胞内Ras相关蛋白Rab7,肌动蛋白dynein,溶酶体等蛋白或细胞器的结合,我们用免疫荧光对肿瘤细胞内蛋白染色,对其进行共定位分析;(8)为了检测肿瘤细胞来源的囊泡对肿瘤细胞溶酶体pH的影响,我们采用溶酶体sensor染色和酶标仪检测溶酶体检测试剂盒染色计算溶酶体pH;(9)为了检测囊泡对肿瘤生成细胞的化疗增敏效果,我们用3D软胶培养肿瘤生成细胞,并用囊泡处理细胞检测化疗药物对肿瘤细胞的杀伤抑制;结果:(1)将肿瘤来源的囊泡对荷瘤小鼠膀胱进行预处理,处理后12小时对膀胱进行化疗药物灌洗。经过囊泡预处理的荷瘤小鼠,膀胱内肿瘤与单独化疗药物处理的组相比明显减小,说明囊泡处理能够增强化疗药物的肿瘤抑制作用。(2)将巨噬细胞清除小鼠或者裸鼠进行膀胱内肿瘤接种,之后用化疗药物或者囊泡结合化疗药物进行膀胱内灌洗治疗。处理后,囊泡结合化疗药物组的小鼠明显比单独化疗组有更明显的肿瘤抑制效果,说明囊泡增强化疗药物的肿瘤抑制效果是非T细胞,巨噬细胞依赖的。(3)将囊泡对多种膀胱癌肿瘤细胞进行预处理,发现肿瘤囊泡能够对多种化疗药物在多种膀胱癌细胞上增敏,说明囊泡能够直接作用于肿瘤细胞,增强化疗药物对其杀伤;(4)对囊泡预处理的细胞进行药物摄取和外排的检测,我们发现囊泡处理后的肿瘤细胞能更多地摄取化疗药物,并且囊泡抑制了肿瘤细胞对化疗药物的外排;(5)PCR和western blot检测肿瘤细胞上的ABCB1和多药耐药蛋白表达,我们发现囊泡处理后的肿瘤细胞明显减少了 ABCB1和多药耐药蛋白的表达,因此增强了肿瘤细胞的药物摄取并降低了药物外排;(6)通过siRNA技术将肿瘤细胞的溶酶体敲除,我们发现囊泡无法介导肿瘤细胞的增敏作用,说明囊泡介导的增敏作用是溶酶体依赖的;(7)通过免疫荧光对Rab7,dynein,溶酶体等蛋白或者细胞器染色,我们发现肿瘤来源囊泡处理后,肿瘤细胞内的溶酶体会与溶酶体相关蛋白结合,之后溶酶体相关蛋白通过激活的Rab7与细胞骨架上的纤动蛋白dynein结合,往细胞核方向运动。(8)通过溶酶体sensor和检测试剂盒对囊泡处理过的肿瘤细胞检测发现,肿瘤来源的囊泡能够明显的增强肿瘤细胞内的溶酶体pH;(9)我们通过3D软胶培养了肿瘤生成细胞,并采用囊泡对其进行预处理,发现肿瘤来源的囊泡也能够对肿瘤生成细胞进行化疗药物的增敏;结论:肿瘤来源的囊泡能够被肿瘤细胞摄取,通过降低肿瘤细胞的多药耐药蛋白表达增强肿瘤细胞对药物的摄取,减少药物的外排增强化疗药物的杀伤效果。同时,肿瘤来源的囊泡能够增强肿瘤细胞溶酶体的pH值,促使包裹药物的溶酶体通过溶酶体相关蛋白,Rab7与dynein相结合,将药物往细胞核方向运输,最终药物通过溶酶体上的ABC转运子从溶酶体中逃逸进入细胞核,增强药物对膀胱癌细胞杀伤。肿瘤来源的囊泡作为一种化疗增敏剂,能够有效的增强化疗药物对膀胱癌的抑制,为临床膀胱癌治疗提供一种新的策略。