【摘 要】
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L-丙氨酸在医药、保健品、食品添加剂等行业有广泛应用,因此,L-丙氨酸的高产菌株是市场迫切需要的。本实验室前期构建了丙氨酸产生菌MG1655-714（E.coli K-12 substr.MG1655ΔldhAΔpflBΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-pta）,其L-丙氨酸产量为11.233 g/L,比E.coli K-12 MG1655野生型菌
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L-丙氨酸在医药、保健品、食品添加剂等行业有广泛应用,因此,L-丙氨酸的高产菌株是市场迫切需要的。本实验室前期构建了丙氨酸产生菌MG1655-714（E.coli K-12 substr.MG1655ΔldhAΔpflBΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-pta）,其L-丙氨酸产量为11.233 g/L,比E.coli K-12 MG1655野生型菌株的L-丙氨酸产量高9.683 g/L。并将野生型菌株和基因编辑菌株MG1655-714进行转录组分析,为本课题提供了研究依据。本研究以实验室构建的丙氨酸产生菌MG1655-714为出发菌株,对L-丙氨酸代谢途径进行改造;同时利用鸟枪法在大肠杆菌基因组Sau3AI随机片段中筛选喜厌氧环境启动子,在转录水平和翻译水平比较喜厌氧环境启动子的表达活性,并将喜厌氧环境启动子E27应用于丙氨酸代谢途径,具体研究如下所示:1.以实验室构建的丙氨酸产生菌MG1655-714为出发菌株,通过转录组分析比较,对L-丙氨酸相关的代谢途径进行改造,初步构建成丙氨酸产生菌MG1655-814（E.c oli K-12 substr.MG1655ΔldhAΔpflBΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-ptaΔmetA）、MG1655-815（E.coli K-12 substr.MG1655ΔldhA::alaDΔpfl BΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-ptaΔmetA）、MG1655-816（E.coli K-12 substr.MG1655ΔldhA::alaDΔpfl B::alaDΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-ptaΔmetA）、MG1655-817（E.coli K-12substr.MG1655ΔldhA::alaDΔpfl B::alaDΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-ptaΔmetAΔsad::alaD）、MG1655-818（E.coli K-12 substr.MG1655ΔldhA::alaDΔpfl B::alaDΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-pta::alaDΔmetAΔsad::alaD）。2.将基因编辑的菌株MG1655-814、MG1655-815、MG1655-816、MG1655-817、MG1655-818进行5 L发酵罐发酵实验,L-丙氨酸产量为:20.200 g/L、25.377 g/L、27.773 g/L、28.984 g/L、33.208 g/L。相较于出发菌株MG1655-714的产量11.233 g/L,基因编辑菌株的产量均得到不同程度的提高。该结果表明通过基因编辑调节代谢途径,以提高L-丙氨酸产量的方法是可行的。3.利用鸟枪法在厌氧条件和高氯霉素浓度胁迫下筛选出活性强的29个随机片段,根据测序结果利用Soft Berry在线软件的BPROM细菌启动子分析功能对喜厌氧环境启动子片段进行分析。通过RT-qPCR技术分析喜厌氧环境启动子在转录水平的活性。除E9和E24外,喜厌氧环境启动子在厌氧条件下的mRNA表达量均比有氧条件高。其中,E27的差异表达量最大,在厌氧条件下比有氧条件下的mRNA表达量高5.23倍。通过氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因在表达水平比较喜厌氧环境启动子的活性,E27在厌氧条件下CAT的比酶活比有氧条件下的比酶活高1.68倍。4.在菌株MG1655-815基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将E27替换PldhA,用筛选到的E27表达嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因（alaD）,成功构建菌株MG1655-815-1（E.coli K-12 substr.MG1655ΔPldhA::E27ΔldhA::alaDΔpfl BΔdad X::alaDΔfrdA::alaDΔadh E::alaEΔack A-ptaΔmetA）。菌株MG1655-815、MG1655-815-1发酵后L-丙氨酸的产量为25.377 g/L、27.418 g/L,菌株MG1655-815-1比菌株MG1655-815的L-丙氨酸产量提高了2.041 g/L。说明筛选的喜厌氧环境启动子E27对提高L-丙氨酸的产量具有一定的效果。为今后构建出优良的L-丙氨酸产生菌提供了理论依据和思路。
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