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研究背景:先天性脊柱侧凸（Congenital Scoliosis,CS）是一种由多种病因引起的复杂的脊柱三维畸形,由胚胎时期体节发育异常而出现脊柱椎体的形成障碍和/或分节不良所致。畸形在胚胎期或儿时可出现,脊柱的异常弯曲可导致身材矮小、剃刀背以及胸廓畸形等,影响患儿心肺功能及日常活动,严重时需要手术干预,给患儿造成严重的身心创伤。目前CS的发病机制尚不明确,借助遗传学研究手段探索CS的病因,早期精准诊疗及预测病情进展有着重要的临床意义,也是当前国际上的研究热点。ALPK3编码非典型蛋白激酶家族的α-激酶3,其小鼠同源基因Alpk3（或Midori）在小鼠胚胎期的心脏以及成年时期的心脏和骨骼肌中显著表达。在人类中,ALPK3致病性突变可导致不同程度的扩张性心肌病和/或肥厚性心肌病,其中过半的患者可同时伴有身材矮小、特殊面容、腭裂、颈蹼、关节挛缩及进展性脊柱侧凸/侧后凸等心脏外表现。颅面部畸形、发育迟缓、关节挛缩以及心血管系统病变常在CS患者中作为伴随症状出现,提示ALPK3致病性突变可能是CS的潜在病因之一,然而目前尚未有关于该基因在CS队列中致病性评估的研究。研究目的:本研究拟通过分析CS队列中患者的全外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）信息,筛选ALPK3基因的可疑致病突变,并进一步探索ALPK3基因及其产物的分子生物学功能及其在CS发病过程中的可能作用机制,进一步扩充CS的致病基因谱,为CS的早期诊断和精准治疗提供新的方向和思路。研究方法:第一部分:根据纳入与排除标准,我们对系统解析脊柱侧凸及相关合并症（Deciphering Disorders Involving Scoliosis and COmorbidities,DISCO）国际协作组队列中的420例CS患者的外周血样本进行了 WES和相关分析,使用生物信息学软件筛选出高度可疑致病的ALPK3基因突变位点。第二部分:我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Alpk3基因敲除小鼠模型,采用Miro-CT和骨骼染色等方法对小鼠进行表型验证,观察不同基因型以及不同时间点小鼠脊柱表型的差异。第三部分:我们利用蛋白质组学技术鉴定了纯合型Alpk3基因敲除小鼠（Alpk3-/-）和野生型小鼠椎旁肌组织中的差异蛋白,并通过GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能富集分析初步探究了差异蛋白可能涉及的生物学功能。研究结果:第一部分:我们在420例CS患者中筛选出2例隐性遗传的ALPK3基因复合杂合突变（compound heterozygous variant）,分别为 c.1148G＞A/c.53385339delTG 以及c.4840C＞T/c.3061C＞T,在既往文献中均未被报道过。生信工具打分提示突变具有较高的致病性,考虑为可能致病（likely pathogenic,LP）突变。这2例患者表现出与文献中相似的心肌病合并颅面部-骨骼畸形临床表型,包括不同程度的扩张性心肌病和/或肥厚性心肌病,进行性加重的颈段及胸段/胸腰段脊柱畸形,双眼下斜、张口角小、低耳位等颅面部畸形,以及发际线低、颈蹼、关节挛缩屈曲伴活动受限等。第二部分:我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建Alpk3基因敲除小鼠模型,Micro-CT、骨骼染色等方法证实45.5%（25/55）的纯合小鼠（Alpk3-/-）存在脊柱椎体发育异常或分节不良或进展性的寰枢椎融合等表型,发生率远高于杂合小鼠（Alpk3-/-）和野生型小鼠,且畸形更为严重。此外,我们发现Alpk3--小鼠在不同时期的发病率存在差异,哺乳期后（出生3周后）开始出现脊柱表型,青春期至性成熟期（出生后3-12周）脊柱畸形发病率随周龄增加呈现增长趋势,至成年后（出生后12周）趋于稳定。第三部分:我们对Alpk3-/-小鼠和野生型小鼠的脊柱椎旁肌进行了蛋白质组学分析,共鉴定出79种差异表达蛋白,其中有16种在Alpk3-/-小鼠中表达显著上调而另外63种显著下调。GO功能分析显示,差异蛋白主要参与调节中心体的复制、聚集等生物过程,富集于高尔基体、兴奋性细胞突触等细胞成分,以及调控转录辅助激活因子、跨膜信号受体以及亚精胺氧化还原酶活性等分子功能。KEGG Pathway分析显示,差异蛋白主要富集于剪接体、谷胱甘肽代谢以及PPAR信号等通路。STRING数据库显示,ALPK3与同为差异表达蛋白的OBSL1存在相互作用关联。研究结论:ALPK3可作为CS的重要致病候选基因,ALPK3基因的复合杂合突变可导致以心肌病合并颅面部-骨骼畸形为特点的CS,且椎体畸形可呈现出进展性加重的特点。我们猜测Alpk3基因的致病突变可能在小鼠出生后的发育过程中发挥重要作用;其致病机制可能为通过影响小鼠椎旁肌机械力学功能以及分化、再生、脂代谢等生理过程,影响脊柱的正常发育。Alpk3和Obs11可能存在相互作用或在骨骼畸形的发病中存在相似的致病机制。此外,Alpk3基因敲除小鼠模型可较好地模拟ALPK3基因缺陷患者的临床表现,可作为后续研究基因功能以及致病机制的有力工具。