【摘 要】
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背景:结核潜伏感染（LTBI）人群是一个庞大的活动性肺结核（ATB）潜在患者库,针对LTBI人群中的发病高风险人群进行预防性治疗是降低社区发病率的直接手段,也是落实“精准干预”的必然需求。探索与LTBI发病以及LTBI治疗反应相关的分子标识将为更加快速准确的界定干预对象、实时评价干预目标人群对预防性治疗的反应提供技术支撑,服务适宜国情的结核病预防性治疗技术体系的完善。方法:利用前瞻性研究建立的生物
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背景:结核潜伏感染（LTBI）人群是一个庞大的活动性肺结核（ATB）潜在患者库,针对LTBI人群中的发病高风险人群进行预防性治疗是降低社区发病率的直接手段,也是落实“精准干预”的必然需求。探索与LTBI发病以及LTBI治疗反应相关的分子标识将为更加快速准确的界定干预对象、实时评价干预目标人群对预防性治疗的反应提供技术支撑,服务适宜国情的结核病预防性治疗技术体系的完善。方法:利用前瞻性研究建立的生物样本,采用巢式病例对照设计,分别开展与LTBI发病相关的DNA甲基化分子标识研究以及与预防性治疗反应相关的外泌体蛋白分子标识研究。具体如下:1.筛选与LTBI发病相关的甲基化位点:基于一项以探索LTBI超短程干预方案为目的的随机对照临床试验,回顾性的检测宿主全基因组DNA甲基化水平以获得LTBI与ATB鉴别诊断的生物标志物。采用Infinium Methylation EPIC BeadChip 850K芯片分析未接受预防性治疗的60份外周血样本（其中包括随访过程中诊断的15例发病患者的基线及诊断时各一份外周血单核细胞样本,和性别年龄匹配的15例未发病的LTBI者基线及随访终点各一份外周血单核细胞样本）。选择位于CPG岛启动子区的差异甲基化位点（p＜0.05,|β|＞0.10）,使用受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）和世界卫生组织（WHO）目标产品基准（TPP）的90%灵敏度下的特异度来评估其筛查及诊断效能。2.筛选及验证与预防性治疗反应相关的血浆外泌体蛋白:为获得评价结核病预防性治疗反应相关的分子标识,基于一项以探索预防性治疗方案的随机对照试验,对参与预防性治疗的80份LTBI研究对象的血浆外泌体进行Label free定量蛋白质谱分析,其中包括20名预防性治疗后γ-干扰素（IFN-y）释放试验（IGRA）转阴（转阴定义:干预前IFN-γ＞0.70 IU/ml,干预后一周内IFN-γ＜0.20 IU/ml）的转阴组和20名预防性治疗后IGRA持续阳性的对照组自身前后各两份样本,探索不同治疗反应下的差异外泌体蛋白,并扩大样本量采用平行反应检测法（PRM）验证。结果:1.筛选与LTBI发病相关的甲基化位点:850K芯片分析了 60份外周血单核细胞的863159个甲基化位点,最终获得8个可用于LTBI人群筛查和诊断ATB的差异甲基化位点。ROC分析显示,8个差异甲基化位点的AUC介于0.72～0.84之间。在WHO TPP给定的90%敏感性下,cg14593639的特异性最高,为66.67%（95%CI:41.71,84.82）。联合 ROC 分析表明“cg02206980+cg02214623+cg12159502+cg12321798”表现最佳,AUC 为 0.88（95%CI:0.72,0.97）,敏感性为 93.33%（95%CI:70.18,99.66）,特异性为 86.67%（95%CI:62.12,97.63）。2.筛选及验证与预防性治疗反应相关的血浆外泌体蛋白:Label free定量蛋白质谱分析共检测了 80份样本的2321个外泌体蛋白,其中102个外泌体蛋白在IGRA转阴组预防性治疗前后表达差异有统计学意义,并在持续阳性组治疗前后无差异,同时预防性治疗前两组亦无差异。从中选择100%有原始数值,并经生物信息学分析后,共得到9个目标蛋白用于下一步的验证。在另外120例用于验证的外周血血浆中（转阴组30名预防性治疗前各后两份样本,持续阳性组30名预防性治疗前后各2份样本）,验证得到外泌体蛋白S100A9和C4BPA在转阴组预防性治疗治疗前后表达下调（p＜0.05）,在持续阳性组治疗前后无差异并且基线时两组亦无差异,与筛选结果一致。结论:SIRT1等基因启动子区CPG岛高甲基化可能作为LTBI与ATB鉴别诊断的候选生物标志物,仍需在其他样本中验证并完善相关机制研究;外周血外泌体蛋白S100A9和C4BPA与结核病预防性治疗的积极反应相关,为下一步机制研究提供了基础性数据,为探索服务“精准干预”的分子标识奠定了工作基础。
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