目的：　　伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi, S. Typhi）是引起人类伤寒热的病原体，也是一种重要的原核生物基因表达调控研究模式菌。有研究表明，细菌中存在众多调节型非编码RNA包括蛋白编码基因RNA的非翻译区（untranslated region, UTR），它们参与调控细菌生长、代谢、毒力等多个方面。前期研究利用 RNA-seq 分析 S.Typhi的转录组，发现大量假定的非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）及UTR，其功能和分子作用机制还有待深入的研究。本研究主要针对S. Typhi的2个可能的UTR，RibE-3’UTR和GalU-3’UTR开展研究，以期阐明其分子及表达调节特性、功能和作用机制等。　　方法：　　1. 分子特征鉴定　　运用Northern blot检测S. Typhi野生株中ncRNA RibS及其上游基因ribE、ncRNA AS-Hns及其上游基因galU的表达，初步鉴定RibS和AS-Hns的存在及其3’ UTR来源；运用5’磷酸依赖的外切酶消化分析鉴定RibS和AS-Hns的5’末端磷酸基团特性，以判断其属于剪切产物或转录产物；运用Northern blot检测6种RNA酶（RNase I、RNase III、RNase E、RNase G、RNase PH、RNase T）缺陷变异株中RibS和AS-Hns的表达，确定其关键剪切酶；运用5’ RACE和3’ RT-PCR分别检测RibS和AS-Hns的起始位点和终止位点，确定其全长序列和3’ UTR来源。　　2. 表达特性分析　　将S. Typhi野生株分别培养至迟滞期（OD600 0.3）、对数中期（OD600 0.8）、对数晚期（OD600 1.3）和稳态期（OD600 2.0），提取总RNA，用Northern blot检测RibS和AS-Hns的表达；将S. Typhi野生株培养至对数早期（OD600 0.4）并在酸、氧和高渗条件下继续培养30min，用Northern blot检测RibS和AS-Hns的表达。　　3. 功能分析　　用pBAD/HisA质粒构建重组载体pBADH-ribS、pBADH-ashns和pBADH-hnst并分别转化至 S. Typhi 野生株，制备 RibS 高表达菌株 WT-pRibS、AS-Hns 高表达菌株WT-pASHns、hns mRNA高表达菌株WT-pHnst和对照株WT-pBADH；对WT-pRibS、WT-pASHns和WT-pBADH进行生长曲线测定、泳动试验、生物膜形成检测（结晶紫染色法）、药敏试验（K-B纸片法）、HeLa细胞侵袭试验和THP1细胞生存试验；对WT-pHnst和WT-pBADH进行泳动试验。　　4. 作用机制研究　　⑴ 对靶基因表达的影响：　　① RNA水平：用qRT-PCR检测WT-pRibS和WT-pBADH中cfa和ydhC的mRNA水平、WT-pASHns和WT-pBADH中hns的mRNA水平以及WT-pHnst和WT-pBADH中galU 的 mRNA 水平；将 ribS 反义序列克隆至 lacZ 融合质粒 pHRP309 构建重组质粒pHRP309-ASribS ， 将其分别转 化至 WT-pRibS 和 WT-pBADH ，构 建菌株WT-pRibS/pASribS 和 WT-pBADH/pASribS，检测其β-半乳糖苷酶活性以反映 cfa 的mRNA水平；用Northern blot分析WT-pHnst和WT-pBADH中galU的mRNA水平。② 蛋白水平：用自杀质粒介导的同源重组法构建染色体 3?Flag 融合菌株 Cfa::Flag、YdhC::Flag 、Hns::Flag和GalU::Flag，将相应高表达载体和空质粒分别导入，构建菌株Cfa::Flag-pRibS 和 Cfa::Flag-pBADH、YdhC::Flag-pRibS 和 YdhC::Flag-pBADH、Hns::Flag-pASHns和Hns::Flag-pBADH以及GalU::Flag-pHnst和GalU::Flag-pBADH；用Western blot分别检测融合蛋白Cfa-Flag、YdhC-Flag、Hns-Flag及GalU-Flag的水平。⑵ 靶基因的功能分析：　　用自杀质粒介导的同源重组法制备△cfa和△galU；用pBAD/Myc-HisA质粒构建重组载体pBADM-cfa，将pBADM-cfa和空质粒分别转化至S. Typhi野生株和△cfa，制备野生型对照株WT-pBADM、缺陷型对照株△cfa-pBADM、cfa回补株△cfa-pcfa和cfa高表达株WT-pcfa并检测其生物膜形成；用pBAD/HisA质粒构建重组载体pBADH-galU，将pBADH-galU和空质粒分别转化至△galU，制备缺陷型对照株△galU-pBADH和galU回补株△galU-pgalU并检测其动力。　　⑶ 是否存在其他靶基因：　　将pBADH-ribS和pBAD/HisA分别转化至△cfa，制备△cfa-pRibS和△cfa-pBADH并检测其生物膜形成；将pBADH-hnst和pBAD/HisA分别转化至△galU，制备△galU-pHnst和△galU-pBADH并检测其动力。　　结果：　　1. RibE-3’ UTR　　⑴ 分子特征：Northern blot分析证实了RibS的存在并初步揭示RibS来源于RibE-3’ UTR；5’磷酸依赖的外切酶消化分析和剪切酶鉴定结果显示RibS是RNase III的剪切产物；5’RACE分析结果显示RibS的5’末端剪切位点位于ribE终止密码子下游916nt处，且还可能存在两个上游起始位点；3’ RT-PCR结果显示RibS的3’末端终止位点位于ribE终止密码子下游1599~1661nt。　　⑵ 表达特性：Northern blot分析结果显示，RibS的表达水平在普通生长条件下高于ribE全长转录产物，且随生长逐渐升高并在对数晚期达到顶峰，进入稳态期后稍有回落；RibS在酸、氧和高渗应激条件下的表达水平均稍有降低。　　⑶ 功能：成功制备了WT-pRibS和WT-pBADH。WT-pRibS和WT-pBADH的生长、动力、药物敏感性和在巨噬细胞内的存活均没有明显差异；WT-pRibS 的生物膜形成和对HeLa细胞的侵袭力明显强于WT-pBADH。　　⑷ 作用机制：　　① RibS对cfa和ydhC表达的影响：qRT-PCR结果显示，WT-pRibS中cfa的mRNA水平明显高于WT-pBADH，而ydhC的mRNA水平在WT-pRibS和WT-pBADH中没有明显差异。β-半乳糖苷酶活性检测结果显示，WT-pRibS/pASribS的?-半乳糖苷酶活性明显高于 WT-pBADH/pASribS。Western blot 分析结果显示，在阿拉伯糖（Ara）诱导 0min和30min时，Cfa::Flag-pBADH和Cfa::Flag-pRibS中Cfa-Flag融合蛋白的水平没有明显差异，而在60min时Cfa::Flag-pRibS中Cfa-Flag融合蛋白的水平与Cfa::Flag-pBADH中相比明显升高；在 Ara 诱导 0min、30min 和 60min 时， YdhC::Flag-pRibS 和YdhC::Flag-pBADH中YdhC-Flag融合蛋白的水平均没有明显差异。　　② cfa 对生物膜形成的影响：成功制备了△cfa、△cfa-pBADM、△cfa-pcfa、WT-pBADM和 WT-pcfa。生物膜形成检测结果显示，△cfa 的生物膜形成明显弱于野生株；△cfa-pBADM 的生物膜形成明显弱于 WT-pBADM ，△cfa-pcfa 的生物膜形成稍强于△cfa-pBADM；WT-pcfa生物膜形成明显强于WT-pBADM。　　③ RibS影响生物膜形成与cfa相关性：成功制备了△cfa-pBADH和△cfa-pRibS。生物膜形成检测结果显示，△cfa-pRibS的生物膜形成仍稍强于△cfa-pBADH。　　2. GalU-3’ UTR　　⑴ 分子特征：Northern blot分析证实了AS-Hns的存在并初步揭示AS-Hns来源于GalU-3’ UTR；5’磷酸依赖的外切酶消化分析和剪切酶鉴定结果显示AS-Hns是未知RNase的剪切产物；5’ RACE分析结果显示AS-Hns的5’末端剪切位点位于galU终止密码子下游59nt处，且还可能存在两个上游起始位点；3’ RT-PCR结果显示AS-Hns的3’末端终止位点位于galU终止密码子下游584~701nt。　　⑵ 表达特性：Northern blot分析显示，AS-Hns的表达水平在普通生长条件下低于galU全长转录产物且随细菌生长逐渐降低；AS-Hns的表达在酸、氧和高渗应激下均下降。⑶ 功能：成功制备了WT-pASHns。WT-pASHns和WT-pBADH的动力、生物膜形成和药物敏感性均没有明显差异；WT-ASHns 的生长从第 5h 开始慢于 WT-pBADH，且WT-ASHns对HeLa细胞的侵袭力和在巨噬细胞内的生存能力均明显弱于WT-pBADH。⑷ AS-Hns对hns表达的影响：qRT-PCR分析显示，WT-pASHns中hns的mRNA水平明显低于 WT-pBADH；Western blot 分析显示，在 Ara 诱导 0min 和 30min 时， Hns::Flag-pASHns和Hns::Flag-pBADH中Hns-Flag融合蛋白的水平没有明显差异，而在Ara诱导60min 和90min 时，Hns::Flag-pASHns 中 Hns-Flag融合蛋白的水平明显低于Hns::Flag-pBADH。　　⑸ GalU-3’ UTR对galU表达的影响　　① hns mRNA高表达对galU表达的影响：成功构建了hns mRNA高表达菌株WT-pHnst。qRT-PCR分析显示，WT-pHnst中galU的mRNA水平稍低于WT-pBADH；Northern blot分析显示，WT-pHnst 中 galU 全长转录产物的水平明显低于 WT-pBADH，且剪切加工产物和AS-Hns的水平明显升高；Western blot分析显示，在Ara诱导0min和30min时， GalU::Flag-pHnst和GalU::Flag-pBADH中GalU-Flag融合蛋白的水平没有明显差异，而在 Ara 诱导 60min 时， GalU::Flag-pHnst 中 GalU-Flag 融合蛋白的水平明显低于GalU::Flag-pBADH。　　② galU 对动力的影响：成功制备了△galU、△galU-pBADH 和△galU-pgalU。泳动试验结果显示，△galU的动力明显弱于野生株，△galU-pBADH的动力明显弱于WT-pBADH，△galU-pgalU的动力明显强于△galU-pBADH。　　③ hns mRNA 高表达对动力的影响：泳动试验结果显示，WT-pHnst 的动力明显弱于WT-pBADH；qRT-PCR 分析显示，与 WT-pBADH 相比，WT-pHnst 中三级鞭毛基因的表达水平均下降。　　④ hns mRNA 高表达对动力的影响与 galU 相关性：成功制备了△galU-pBADH 和△galU-pHnst。泳动试验结果显示，△galU-pHnst和△galU-pBADH的动力没有明显差异。　　结论：　　1. RibE-3’ UTR　　本研究发现RibE有一个较长的3’ UTR，且此3’ UTR经RNase III剪切产生一个684~746nt的ncRNA RibS；RibS的表达水平比ribE全长转录产物高且随生长时期和应激而变化；RibS高表达能够促进S. Typhi的生物膜形成和对HeLa细胞的侵袭；RibS可以作为一个反义RNA正向调控其对侧链靶基因cfa的表达；cfa的表达能够促进S. Typhi的生物膜形成；RibS通过调控cfa和其他未知的靶基因来促进S. Typhi的生物膜形成。2. GalU-3’ UTR　　本研究发现GalU的3’末端有一个较长的UTR及一个526~643nt的降解产物AS-Hns；AS-Hns的表达水平比galU全长转录产物低且随生长时期和应激而变化；AS-Hns高表达能够抑制S. Typhi的生长、对HeLa细胞的侵袭和在巨噬细胞内的存活；AS-Hns作为一个反义RNA负向调控其对侧链靶基因hns的表达。此外，GalU-3’ UTR具有自调节作用，能够与hns mRNA结合，促进galU转录产物的剪切和AS-Hns的产生，致使galU的mRNA和蛋白水平均降低；galU缺失导致S. Typhi的动力减弱；hns mRNA作为一个双功能RNA与GalU-3’ UTR结合能抑制galU的表达从而减弱S. Typhi的动力。