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第一部分mi R-299-5p在骨肉瘤中的表达目的明确mi R-299-5p在骨肉瘤中的表达及其与骨肉瘤临床预后的关系。方法GEO数据库中搜索骨肉瘤mi RNA的相关数据信息及患者临床资料(GSE65071、GSE39040和GSE39055)。本研究收集自2015年09月到2017年09月在南京中医药大学附属沭阳医院骨科收治的5例骨肉瘤患者的新鲜组织标本,同时收集其临床病理资料。q RT-PCR检测组织标本中mi R-299-5p的表达。采用Cox单因素和多因素回归分析和Log-rank分析推测mi R-299-5p与骨肉瘤临床预后的关系。采用t检验和卡方检验分析组间的差异。p<0.05差异具有统计学意义。结果GSE65071数据库中包含20例骨肉瘤患者和15例正常人的血清样本信息;GSE39040数据库包含65例骨肉瘤患者的预后,年龄,性别等信息;GSE39055包含65个与GSE39040数据库中同样的病人的预后,年龄,性别等信息。数据库分析提示:mi R-299-5p在骨肉瘤患者血清中的表达水平要显著高于正常人血清中mi R-299-5p的表达水平,差异具有统计学意义(p<0.001)。同样在数据库中,根据Kaplan-Meier法和log-rank法分析mi R-299-5p在骨肉瘤中的表达,结果显示mi R-299-5p的中位表达值(median expression value)为8.437213。根据该值将所有数据库中的临床病例分为mi R-299-5p高表达组和mi R-299-5p低表达组。mi R-299-5p高表达组的生存率显著低于mi R-299-5p低表达组的生存率(p<0.001)。年龄、性别和坏死范围在mi R-299-5p高表达组和mi R-299-5p低表达组中无显著差异(p>0.05)。Cox单因素回归分析提示:mi R-299-5p的表达水平和肿瘤坏死率是影响骨肉瘤预后的因素(HR=3.144,p=0.007;HR=0.621,p=0.016),与性别和年龄无关(HR=0.764,p=0.615;HR=1.001,p=0.959)。Cox多因素回归分析提示:mi R-299-5p的表达水平和肿瘤坏死率是影响骨肉瘤预后的因素(HR=2.460,p=0.020;HR=0.657,p=0.016),与性别和年龄无关(HR=0.654,p=0.468;HR=0.962,p=0.346)。ROC生存曲线结果得出:mi R-299-5p的表达水平可以预测骨肉瘤的预后(AUC=0.704)。Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析:mi R-299-5p主要影响骨肉瘤细胞的细胞周期。q RT-PCR检测结果显示mi R-299-5p在骨肉瘤组织中的表达较癌旁正常组织中的表达均显著增高,差异具有统计学意义(p<0.001)。结论mi R-299-5p在骨肉瘤血清中表达上调,其表达水平作为影响骨肉瘤预后的独立因素。同时,mi R-299-5p可能通过调节细胞周期从而影响骨肉瘤细胞的增殖,影响骨肉瘤患者的预后。第二部分mi R-299-5p在骨肉瘤增殖中的功能机制研究目的明确mi R-299-5p在骨肉瘤中的生物学功能及其功能机制。方法采用q RT-PCR方法检测骨肉瘤细胞系中mi R-299-5p的表达情况;采用慢病毒转染构建稳定过表达和低表达mi R-299-5p的U2和MG-63骨肉瘤细胞系;采用CCK-8实验及克隆形成技术检测细胞的增殖;采用流式细胞技术监测细胞周期;采用裸鼠皮下种植稳定过表达mi R-299-5p的MG-63骨肉瘤细胞观察其成瘤情况;采用q RT-PCR方法检测相关基因在m RNA水平的表达;采用Western blot方法检测细胞内Cyclin E、Cyclin D、CDK、p16和p21等细胞周期相关分子在蛋白水平的表达。结果mi R-299-5p在U2和MG-63骨肉瘤细胞系中的表达显著高于在h FOB1.19细胞(对照)的表达(p<0.001)。克隆形成实验结果显示:mi R-299-5p-inhibitor组的细胞增殖显著低于mi R-299-5p-inhibitor-NC组;mi R-299-5p-mimics组的细胞增殖活性显著高于mi R-299-5p-mimics-NC组。CCK-8实验结果显示:mi R-299-5p-inhibitor组的细胞增殖活性显著低于mi R-299-5p-inhibitor-NC组;mi R-299-5p-mimics组的细胞增殖活性显著高于mi R-299-5p-mimics-NC组。流式细胞技术实验结果显示:mi R-299-5p-inhibitor组的细胞周期停滞在G0/G1期,mi R-299-5p-mimics组表现为骨肉瘤细胞的细胞周期G1期向S期转换。Western blot实验结果显示:mi R-299-5p-inhibitor组的Cyclin E、Cyclin D和CDK的蛋白表达水平显著低于mi R-299-5p-inhibitor-NC组;mi R-299-5p-inhibitor组的p16和p21的蛋白表达水平显著高于mi R-299-5p-inhibitor-NC组。mi R-299-5p-mimics组的Cyclin E、Cyclin D和CDK的蛋白表达水平显著高于mi R-299-5p-mimics-NC组;mi R-299-5p-mimics组的p16和p21的蛋白表达水平低于mi R-299-5p-mimics-NC组。裸鼠成瘤实验结果显示:mi R-299-5p-mimics组的成瘤在瘤体的体积和重量上显著高于mi R-299-5p-NC组。q RT-PCR结果显示:在裸鼠成瘤组织中,mi R-299-5p在mi R-299-5p-mimics组中的表达要显著高于mi R-299-5p在mi R-299-5p-NC组的表达。结论过表达mi R-299-5p能够显著促进U2和MG-63骨肉瘤细胞的生长与增殖,这与调节细胞周期蛋白Cyclin E、Cyclin D、CDK、p16和p21的表达有关。过表达mi R-299-5p能够显著促进骨肉瘤细胞MG-63的裸鼠体内生长。第三部分mi R-299-5p靶向调控CDKN1A基因在骨肉瘤增殖中的功能机制研究目的寻找并验证mi R-299-5p的靶基因。方法运用生物信息学软件对mi R-299-5p的靶基因进行预测。采用qRT-PCR及Western blot实验方法检测过表达和低表达mi R-299-5p的U2和MG-63骨肉瘤细胞中CDKN1A在m RNA水平及蛋白水平的表达。采用分子克隆实验方法构建野生型及突变型p GL3-CDKN1A-3’UTR重组质粒,以及si-CDKN1A和pc DNA-CDKN1A重组质粒。采用荧光素酶报告基因实验检测mi R-299-5p与CDKN1A基因3’UTR区的结合情况。采用CCK-8方法检测细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞周期。结果运用Target Scan、mi RDB和mi RTar Base软件查询mi R-299-5p的靶基因信息,发现CDKN1A为mi R-299-5p潜在的作用靶基因之一。双荧光素酶报告基因实验结果显示在转染p GL3-CDKN1A-3’UTR-wild type质粒的HEK293T细胞中,加入mi R-299-5p质粒的实验组与加入空质粒的对照组相比,荧光素酶活性显著下调;在转染p GL3-CDKN1A-3’UTR-mutant type质粒的HEK293T细胞中,加入mi R-299-5p质粒的实验组与加入空质粒的对照组相比,荧光素酶活性无显著差异。q RT-PCR实验结果显示:CDKN1A基因在U2和MG-63骨肉瘤细胞中的表达显著低于CDKN1A基因在h FOB1.19细胞中的表达(p<0.001)。同时,CDKN1A基因骨肉瘤样本组织中的表达显著低于CDKN1A基因在癌旁正常组织中的表达(p<0.001),且CDKN1A基因的m RNA表达水平与mi R-299-5p的表达水平呈负相关(R2=0.904,p<0.013)。Western blot实验结果显示:CDKN1A在mi R-299-5p-inhibitor组中的蛋白表达水平显著高于mi R-299-5p-inhibitor-NC组;CDKN1A在mi R-299-5p-mimics组中的蛋白表达水平显著低于mi R-299-5p-mimics-NC组。CCK-8结果显示:mi R-299-5p-mimics组中的细胞增殖活性在转染48h、72h和96h均显著高于同时间段的mi R-299-5p-mimics-NC组和mi R-299-5p-mimics+pc DNA-CDKN1A组,差异具有统计学意义;mi R-299-5p-inhibitor组中的细胞增殖活性在转染48h、72h和96h均显著低于同时间段的mi R-299-5p-inhibitor-NC组和mi R-299-5p-inhibitor+si-CDKN1A组,差异具有统计学意义。流式细胞技术实验结果显示:mi R-299-5p-mimics和pc DNA-CDKN1A质粒共转染可以阻滞由mi R-299-5p-mimics所加速的骨肉瘤细胞周期转换。mi R-299-5p-inhibitor和si-CDKN1A共转染可以扭转由mi R-299-5p-inhibitor所致的骨肉瘤细胞周期的停滞。结论荧光素酶报告基因实验结果证实了CDKN1A是mi R-299-5p直接作用的靶基因。我们在U2和MG-6骨肉瘤细胞中进一步证实了mi R-299-5p与CDKN1A之间的靶向关系。