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目的RTN4是定位于内质网的网状蛋白家族成员蛋白,广泛参与神经细胞内分泌和膜转运等多种生理病理过程。研究表明,RTN4与Bcl-2和Bdl-XL样家族存在相互作用进而在人类癌症细胞凋亡途径中发挥作用。尽管RTN4在结直肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胶质瘤、膀胱癌等多种癌症中均有相关报道,但其在前列腺癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探索RTN4在人前列腺癌发生发展中的作用及机制,为前列腺癌的治疗提供潜在的治疗靶点。方法1、采用TCGA数据挖掘分析前列腺癌及正常前列腺组织中RTN4的DNA拷贝数和表达谱。2、通过TargetScan Human 7.0和miRDB预测特定基因3 ’-UTR区中的microRNA结合位点。通过dbDEMC 2.0对人前列腺癌中差异表达的miRNAs进行子分析。在miRTarBase上获得子miRNA的共表达谱以及双荧光素酶基因报告进行验证。3、采用实时荧光定量RT-PCR检测PC-3、DU145、LNCaP细胞系中RTN4 mRNA的表达水平。4、运用Western Blot检测PC-3、DU145、LNCaP细胞系中RTN4蛋白的表达水平。5、构建基因过表达重组慢病毒及重组慢病毒在DU145和LNCaP细胞中的转染,运用Western Blot检测转染后DU145和LNCaP细胞中RTN4蛋白的表达水平。6、采用MTT法检测转染后DU145和LNCaP细胞的增殖情况,并绘制增殖曲线比较分析,采用克隆形成实验检测转染后DU145和LNCaP细胞的细胞增殖情况。7、运用流式细胞术和SA-β-gal染色对转染的DU145细胞的细胞周期和细胞衰老进行分析。8、通过数据库挖掘对RTN4的磷酸化及其位点进行分析。结果1、数据库挖掘显示:RTN4在前列腺癌中的DNA拷贝数高于正常前列腺,而其mRNA和蛋白的表达相对较低。2、数据库挖掘、MicroRNA.cog预测和双荧光素酶分析显示:染色体邻接基因EML6在前列腺癌组织和细胞系中与RTN4表达模式相似,它们均可被miR-148a-3p 靶向。3、实时荧光定量RT-PCR检测PC-3、DU145、LNCaP细胞系中RTN4 mRNA的表达水平显示:与DU145和LNCaP细胞相比,PC-3细胞RTN4 mRNA表达水平显著增高。4、Western Blot检测PC-3、DU145、LNCaP细胞系中RTN4蛋白的表达水平显示:三种细胞均可表达RTN4,与DU145和LNCaP细胞相比,PC-3细胞RTN4蛋白表达水平明显增高。5、Western Blot检测转染后DU145和LNCaP细胞中RTN4蛋白的表达水平显示:与对照组相比,转染后DU145和LNCaP细胞中RTN4蛋白表达水平明显增高。6、MTT法检测转染后DU145和LNCaP细胞的增殖情况及克隆形成实验检测转染后DU145和LNCaP细胞的细胞克隆情况显示:与对照组相比,慢病毒介导的RTN4过表达的DU145和LNCaP细胞的增殖明显降低,细胞克隆生长数明显减少。7、流式细胞术对转染的DU145细胞的细胞周期进行分析显示:RTN4过表达的DU145细胞中有40.2%处于G0/G1期,而在对照组中这一比例为44.6%。此外,28.5%的RTN4过表达细胞处于G2/M期,而对照组仅22.4%(图5A),说明细胞周期在G2/M期被阻断(P<0.05),SA-β-gal染色对细胞衰老进行分析显示:RTN4过表达前列腺癌细胞自发衰老。8、数据库挖掘正常前列腺和肿瘤组织的相互作用网络显示:RTN4可能分别在酪氨酸591和丝氨酸107位点被MAPKAPK2和FYN磷酸化。结论1、在前列腺癌组织中RTN4 mRNA和蛋白表达显著低于正常前列腺组织。2、RTN4过表达有效抑制前列腺癌细胞增殖。3、RTN4有可能成为前列腺癌选择性靶向治疗药物的新靶点。