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生物的行为受到多种因素,如外部刺激、内在环境变化、过往经历以及神经元结构等影响,能够反映神经系统的活性。因此,行为学实验正日益成为科研工作者一个简单、灵敏的工具来研究神经系统的功能。多细胞模式生物秀丽隐杆线虫具有易于培养、便于基因操控、繁殖周期短、神经元连接图谱可知等优点,现已被广泛的用于基础生物学研究。 线虫行为呈现多样性,涵盖了复杂多样的爬行行为、觅食、排泄、交配、产卵行为以及对不同外界环境的趋向性行为。传统方法是基于一个开放的环境在琼脂糖表面设计环境因素刺激线虫观察其行为。由于与外界环境相通,设计的环境因素不具有精确的可控性。另外,单纯的琼脂糖表面限制了刺激手段的多样性。微流控芯片近年来发展迅速,基于其诸多的优点,如可精确的操控、良好的透气性,最重要的是芯片的通道尺寸和线虫身体的尺寸能够完美的匹配以及芯片的结构可以多样化设计,使得微流控芯片作为一个很好的平台被广泛的用于线虫的行为学研究。本文设计了多种微流控芯片,研究了线虫的多种行为学,探究了其机理,主要研究成果如下: 1、提出并设计了基于柱子阵列的“泥土芯片”,模拟土壤环境,探讨了线虫对空间的感知探索行为。通过改变微柱的间距可以精确控制空间的大小,借助于观察绿色荧光蛋白(GFP)标记的转录因子(DAF-16)在细胞中的定位,分析线虫对不同空间尺寸的感知。实验发现,线虫确实能够感受到狭窄的空间,表现出很强的DAF-16核定位。狭窄的空间会引起胁迫反应,推测基于PDMS薄膜形变及楔形通道实现线虫固定的方法也会对线虫产生胁迫反应。鉴于此,设计了一种基于气体的无胁迫固定方法,实现了30 min内的无胁迫固定,并且可逆。 2、行为学实验需要大量同步化的线虫,因为不同时期的线虫有着各方面的特异性特征,这使得不同时期线虫的分选意义重大。本文首先根据线虫的偏转电趋向性,设计了扇形的PDMS和琼脂糖的杂合芯片,在10 V/cm的电场强度下首次高效的实现了不同时期线虫的同步化分选。基于线虫电趋向性,设计了PDMS和琼脂糖的杂合多级过滤芯片,实现了不同时期线虫的同步化高通量分选。 3、在过滤分选时发现,线虫爬过柱子阵列的时间逐渐减少,推测是一种学习行为。研究发现,整个学习过程很快,但记忆时间很短,机械感知神经元在这一过程中发挥重要作用。本文进一步设计了可实现双重刺激的芯片,探讨了机械感知和食物的联合学习和记忆行为。实验发现,该学习行为具有可塑性并有长时间的记忆。不同的机械感知和神经递质的突变会减弱学习能力或者记忆。内源性多巴胺信号的加强能够延长记忆的时间,但不会影响学习能力。4 mM的外源性多巴胺不仅增强了学习能力,还延长了记忆时间。 4、基于线虫的化学趋向性,本文设计了简单的PDMS和琼脂糖的旋转芯片,探究了线虫在不同条件下的信息交流行为。实验发现,在饥饿的条件下,线虫留下的信息会使后续线虫产生回避行为。在有食物的条件下,少量线虫短时间留下的信息会产生趋向性行为,随着线虫数量的增多以及时间的延长,逐渐变为回避行为。进一步研究发现,雌雄同体和雄性体各自的信息交流策略不同,即使在饥饿的条件下,雄性体留下的信息也不会引起回避行为。利用此方法可进一步研究两性之间的相互交流。 综上所述:本文发展了微流控芯片新方法,研究了线虫的空间感知探索行为,设计了一种基于氮气的无胁迫的可逆固定方法;基于线虫的偏转电趋向性行为首次实现了不同时期的同步化分选,并在电场驱动下通过多级过滤的方法进一步提高了分选通量、效率和纯度;探讨了线虫基于机械感知的非联合型和联合型学习行为;基于线虫的化学趋向性探究了同性以及异性之间在不同条件下的信息交流行为,发现了交流策略的差异。这些尝试为线虫的行为学研究提供了更多、更好的方法平台,将促进线虫的行为学研究。