【研究背景】骨质疏松症（OP）是一种以骨量减少、骨微结构破坏及骨脆性增加为主要特征的常见慢性疾病。现阶段,OP的治疗存在疗效欠佳、副作用明显、无法改善成骨细胞增殖分化、难以逆转OP进程等问题,限制了患者的医从性及疾病治疗效果。另有学者基于组织工程技术探索了干细胞移植治疗OP的可行性,结果显示干细胞移植虽能提高OP小鼠骨形成能力,但仍存在免疫排斥反应、细胞恶变风险增加、干细胞归巢障碍等诸多难题。因此,目前急需寻找一种在促进骨组织再生的同时又能最大限度减少长期药物暴露所带来潜在危害的治疗方法。外泌体（EXOs）作为一种天然生物学起源和复杂的内源性纳米级载体,可通过受体介导的内吞作用参与骨重建过程中各细胞间的信息交流。与一般纳米载体相比,EXOs可将纳米颗粒大小与无细胞毒性、低免疫原性及高载药量等优势相结合,为抗骨质疏松药物的转运开辟了一条新途径。【方法】本研究依托EXOs优良的自身载药特性,采用皂苷处理法,将成骨促进药物——甲状旁腺激素（PTH1-34）装载入骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的EXOs中,制备出EXOs-PTH独特的内源性复合体,并通过透射电镜观察、纳米颗粒示踪分析（NTA）、免疫印迹（Western blot）检测EXOs形态、粒径分布及膜特异性标志蛋白;采用细胞增殖实验（CCK-8）、碱性磷酸酶染色（ALP）、茜素红染色（ARS）、Western blot分别检测EXOs-PTH对MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化、成骨分化相关蛋白表达的影响。随后,我们通过尾静脉注射给药方式将EXOs-PTH应用于OP小鼠模型体内,药物治疗8周后处死小鼠并进行取材,通过micro-CT扫描分析、组织学及免疫学切片染色、血清骨代谢指标评估药物对OP小鼠治疗效果。【结果】成功提取原代BMSCs,并通过成骨、成脂、成软骨诱导分化实验鉴定其具备多向分化潜能;透射电镜下可见EXOs及EXOs-PTH呈典型囊泡样、盘样结构,EXOs膜结构完整,形态均一,直径分布约为100 nm,且EXOs特异性标志蛋白Tsg101、CD9阳性表达,阴性指标Calnexin未见表达;EXOs-PTH较EXOs粒径略有增加,但总体而言载前药后的EXOs粒径分布无明显差异。体外实验中,CCK-8实验发现,间歇性低浓度应用EXOs-PTH可促进MC3T3-E1细胞增殖;ALP染色、ARS染色结果表明EXOs-PTH可显著促进MC3T3-E1成骨分化,成骨早期标志物ALP表达及成骨晚期评估指标钙结节形成效果均优于单药PTH1-34组;EXOs-PTH的促成骨作用在Western blot实验中也得到证实,EXOs-PTH刺激MC3T3-E1后,细胞内成骨分化相关蛋白OCN、Runx2、Osterix、BMP2的表达明显上调。体内实验中,EXOs-PTH可增强PTH1-34治疗效果,提高药物生物利用度,展现出了强大的促进骨形成能力。micro-CT及组织学染色结果均表明,EXOs-PTH可恢复OP小鼠丢失骨量,促进骨组织再生,EXOs-PTH治疗后的OP小鼠骨密度、骨小梁数目及厚度均优于其余各实验组,且OP小鼠骨髓腔中的脂肪蓄积明显减少;免疫荧光及免疫组化染色可见EXOs-PTH组小鼠骨组织中OCN阳性表达量及Runx2荧光强度较各实验组明显增加;此外,血清ELISA分析结果显示,EXOs-PTH可显著提高OP小鼠骨转换效率,促进骨重建进程,血清中骨代谢指标ALP、OCN、OPN及Runx2水平均显著升高。【结论】综上所述,本研究以骨髓间充质干细胞源性外泌体为载体,成功构建了一种负载PTH1-34的天然药物递送系统,并初步探索了其在促进MC3T3-E1细胞增殖分化中的作用,评估了其在骨质疏松症中的治疗效果。