背景：原发性肝癌（简称肝癌）是一种恶性程度很高、预后很差的肿瘤。联合多种方法进行合理、序贯的综合治疗是肝癌临床治疗趋势，但目前仍无标准的联合治疗方案。高强度聚焦超声（HIFU）联合肝动脉栓塞化疗（TACE）目前已用于不能手术切除中晚期肝癌的治疗，但仍缺乏长期随访结果及比较详细的临床分析，导致该联合方法在中晚期肝癌中的临床作用仍需要进一步明确。放疗也是不能手术切除肝癌的有效非手术治疗方法之一。放疗联合热疗具有协同增效作用，以热效应为主的HIFU联合放疗理论上也具有协同增效作用，二者联合可能会提高肝癌的疗效，但目前相关研究甚少。手术切除、肝移植是已证实的有效延长小肝癌生存的重要方法。肝移植因供肝来源紧张、高昂费用在我国难以普遍开展。近来，临床研究显示以高温效应为主的射频消融治疗小肝癌的临床疗效与手术切除相当。因其具有微创、尽量保留正常肝功能优点，射频消融在小肝癌治疗中的地位越来越受到重视。与射频消融比较，同样以高温效应为主的HIFU具有非侵入性、超声图像实时引导监控下完成整个治疗以及不受肿瘤大小、位置影响等优点，可能是又一种可选的小肝癌治疗方法，但目前相关研究很少。肿瘤干细胞（CSC）具有耐药耐辐射特点，与肿瘤发生、发展及复发转移密切相关，是目前肿瘤研究的热点。对CSC进行靶向性治疗，有利于阻断肿瘤发生发展及其复发转移，可能会提高肿瘤疗效，是肿瘤治疗的一种新思路。肝癌中可能具有与肝癌发生、发展及复发转移密切相关的肝癌CSC。与放射生物效应不同，低强度超声主要通过空化、声化学及机械效应，改变细胞膜通透性、影响细胞信号传导等机制逆转肿瘤多药耐药、改变细胞增殖等。不同于放疗的低强度超声对具有多药耐药、耐辐射及自我增殖、更新特点的CSC有何影响，目前几无相关研究。理论上认为，一旦低强度超声能有效改变CSC生物学特性，抑制肝癌干细胞增值、分化及对放化疗的抗拒，可以采用低强度超声波对肿瘤区域内CSC进行靶向性辐照，不仅可以提高肝癌疗效，还因其采用低强度超声而副反应更小，有效避免了HIFU的并发症及局限性，真正可以安全、无创治疗肿瘤；同时，对超声治疗学提供了一种新方向，是HIFU治疗肝癌研究中的有益补充及提升。目的：1.探讨HIFU联合肝动脉栓塞（TAE）治疗小肝癌的安全性、远期疗效及可行性，探讨HIFU联合TAE在临床治疗小肝癌中的作用。2.探讨HIFU联合TACE治疗不能手术切除中晚期肝癌的安全性、远期疗效及主要预后因素，探讨HIFU联合TACE在临床治疗不能手术切除中晚期肝癌中的作用。3.探讨HIFU联合放疗治疗肝癌的安全性和有效性，探讨HIFU联合放疗治疗肝癌的临床可行性。4.探讨低强度超声对肝癌干细胞样细胞多药耐药(MDR)及细胞增殖的影响，探讨低强度超声对肝癌干细胞的影响。方法：1.30例（30个病灶）不能手术切除伴肝硬化小肝癌接受了HIFU联合TAE治疗，并获得了中长期随访。观察所有患者HIFU前后肝脏功能、肿瘤标志物、增强CT或MRI等的变化。采用Kaplan-Meier法对该组患者进行生存分析。2.对HIFU联合TACE治疗的73例(III A25, ⅣA48)不能手术中晚期肝癌进行了中长期随访，并观察其近远期严重并发症。采用Kaplan-Meier法对该组进行生存分析。对肝癌主要可能预后因素肿瘤分期（UICC1997及2002分期）、性别、年龄、门静脉侵犯、AFP水平、Child-Pugh肝功能分级以及肿瘤数目、肿瘤、大小、肋骨切除、TACE次数、消融效果等13个因素进行单因素分析。单因素分析有统计学意义因素进行Cox回归多因素分析。3.采用HIFU治疗了放疗（3维适形放疗和立体定向放疗）后的20例（原发性肝癌16例，肝内胆管细胞癌4例）患者的25个肿瘤病灶，并进行了随访。观察HIFU前后1周治疗区皮肤、肝功能、外周血血细胞等的变化。HIFU后2周，增强MRI观察肿瘤病灶消融情况。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。4.采用阿霉素（ADM）浓度逐渐提高方法诱导建立MDR肝癌细胞SMMC-7721，并进行MDR鉴定。采用免疫磁珠方法分选CD133阳性和阴性MDR细胞，并用流式细胞仪检测其阳性表达率。用低强度超声辐照CD133阳性和阴性等各分组细胞。采用RT-PCR观察各组细胞MDR1、cyclin D1、β-catenin的mRNA表达，采用Western blot观察各组细胞MDR1、β-catenin转录蛋白表达。结果：1.30例小肝癌平均随访时间（49.7±28.6）个月（12～120个月），中位生存时间及1、3、5年生存率分别依次为82.3个月（95%CI:75.8～108.3个月）及96.7%、73.0%、63.8%。HIFU后2周增强CT或MRI显示，29例肿瘤病灶完整消融，其完整消融率为96.7%（29/30）。1、2、3、4年累积肝内复发转移率分别依次为11.1%、22.3%、41.7%、52.3%。HIFU后未发现严重并发症，如胃肠道穿孔等。中长期随访中，2例出现HIFU治疗区域内2根肋骨骨折。肝功能主要指标外周血总胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度，HIFU前后比较差异均无统计学意义（t检验，各组P>0.05）。22例AFP阳性患者，HIFU前外周血AFP平均为（742.1±1120.9） ng/ml，HIFU后1周平均为（319.9±405.8）ng/ml，前后比较，差异具有统计学意义(t检验， P<0.01）。2.73例患者平均随访时间（11.7±11.1）个月（1～60个月）。随访终止时，51例（69.9%）死亡，死亡原因为肿瘤进展27例、肝功能衰竭18例、上消化道出血3例、感染3例。所有患者中位生存时间与1、2、3年生存率分别依次为12个月（95%CI:9–15个月）与49.1%、18.8%、8.4%。HIFU后2周局部肿瘤影像学评价，33例（45.2%）肝肿瘤完整消融。随访中， HIFU后发生1例肝脓肿；3例严重皮肤烧伤。36例未行肋骨切除中，2例肋骨骨折。单因素分析，肿瘤分期（UICC1997）、肿瘤大小、肿瘤数目、门静脉侵犯、消融效果及年龄具有统计学意义。多因素分析，HIFU消融效果和肿瘤大小具有统计学意义（P=0.001和P=0.013），提示HIFU消融效果和肿瘤大小可能是影响HIFU联合TACE治疗中晚期肝癌预后的独立因素。3.20例肝癌随访时间1～27个月，平均（12.6±8.0）个月，中位生存期和1年生存率分别依次为22个月和87.5%。随访结束时，3例死亡。所有患者HIFU治疗后超声波通过区域皮肤无严重烧伤，且无胃肠道穿孔等严重并发症。肝脏功能主要指标白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素，在HIFU前、后1周比较，差异均无统计学意义（t检验；各组P>0.05）。外周血红细胞、白细胞、血小板计数，在HIFU前、后1周比较，差异无统计学意义（t检验；各组P>0.05）。HIFU后2周增强MRI显示，25个病灶中，16个（64%）完整消融，6个（24%）消融体积百分比≥80%。4. ADM诱导的SMMC-7721细胞对ADM、VCR、DDP均具有显著耐药性，提示其具有多药耐药特性。流式细胞仪结果显示，SMMC-7721亲本细胞与建立的MDR细胞CD133阳性表达率分别依次为1%与10.26%；免疫磁珠分选CD133阴性MDR细胞CD133阳性表达率为0.005%，而免疫磁珠分选阳性细胞CD133阳性表达率为45.16%。RT-PCR结果显示，MDR1、cyclinD1、β-catenin（CTNNB1）mRNA在CD133阳性MDR细胞中表达最多；低强度超声辐照后均有不同程度下调。Western blot结果显示，MDR1、β-catenin基因转录蛋白在各研究组细胞中均有表达，但在CD133阳性MDR细胞中表达最高，低强度超声辐照后均有不同程度下降。结论：1. HIFU联合TAE治疗不能手术切除伴肝硬化小肝癌是安全、有效的，可以作为一种不能手术切除或不愿手术切除小肝癌患者可选择的有效综合治疗方法。HIFU联合TAE治疗小肝癌可获取较高肿瘤完整消融率，提示该联合方法可作为一种计划肝移植小肝癌患者移植前有效治疗方法，以减少患者在肝移植等待供肝期间的肿瘤进展而失去肝移植机会或降低肝移植疗效。2.HIFU联合TACE是一种安全有效的不能手术切除中晚期肝癌可以选择的综合治疗方法。HIFU消融效果和肿瘤大小是HIFU联合TACE治疗中晚期肝癌的影响预后的独立因素。独立因素有助于在临床中更好选择适合HIFU联合TACE治疗的中晚期肝癌患者接受治疗，也可以通过独立预后因素进行预后判断。3. HIFU可以安全、有效消融放疗后残留肿瘤，降低肝癌复发，可能会延长患者生存，表明HIFU联合放疗是一种有效肝癌综合治疗方法，可能是是一种安全、有效、可行的可选择新方法。4.逐步增加ADM浓度法可诱导建立MDR SMMC-7721细胞。化疗药物可以提高肝癌干细胞样细胞数量，有利于肝癌干细胞样细胞的富集。低强度超声可能有效逆转肝癌干细胞样细胞的MDR，可能是一种有效改善肝癌干细胞MDR的物理学方法。低强度超声可以抑制肝癌干细胞样细胞Wnt/β-catenin通路传导及其增殖，可能是一种针对干细胞治疗的有效物理学方法。