骨质疏松状态下BMSCs成骨能力及与NF-κB信号通路相关基因的研究

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目的:研究骨质疏松状态下成骨分化的能力及其调控基因。材料与方法:(1)骨质疏松大鼠模型的建立及鉴定:取20只同批次,体重接近,健康状态良好的3月龄雌性SD大鼠,随机分为两组,一组行去势手术(OP组),另一组行假手术(NT组),手术3个月后,通过子宫体重比、血清学和Micro-CT影像学检测对动物模型进行鉴定。(2)骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的分离培养及鉴定:采用全细胞贴壁法分离、培养和纯化BMSCs,观察其细胞形态,并用流式细胞术对其进行鉴定。(3) BMSCs成骨能力差异:成骨诱导后,测定两组细胞碱性磷酸酶(Alkaline PhosPhatase, ALP).骨钙素(Osteocalcin,OC)在7d和14d时的表达差异,茜素红染色检测21天钙结节形成差异。(4)差异基因的筛选和鉴定:两组BMSCs成骨诱导4天后,提取RNA,通过基因芯片技术筛选出与核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路相关的表达差异基因,并用qRT-PCR进行鉴定。结果:(1)OP组与NT组相比,血清雌二醇表达量下降20.09%(p<0.05),体重变化量上升67.65%(p<0.05),子宫体重比测量显示:与NT组相比,OP组下降77.51%(p<0.05),Micro-CT检测显示:与NT组相比,OP组的骨小梁间隔减少,骨质量降低;骨密度(Bone mineral density, BMD)、骨体积分数(Bone volume/Total volume, BV/TV)、骨小梁数目(Trabeculae number, Tb.N)分别减少45.64%、57.08%、60.88%(P<0.05);骨小梁分离度(The Trabecular spacing, Tb.Sp)增加252.01%(P<0.05);(2)流式细胞术鉴定结果显示,表面标记物CD29和CD90.1呈阳性表达,表达率分别为100%和99.2%,CD45和CD11b/c呈阴性表达,表达率分别为2.9%和0.2%;(3)相比于NT组,OP组BMSCs的ALP的7d和14d表达量分别降低46.73%、27.97%(P<0.05);OC的7d和14d表达量分别降低34.63%、47.45%(P<0.05);钙结节形成数量,OP组均明显小于NT组(P<0.05);(4)筛选出1435个表达量差异2倍以上的基因,其中有7个与NF-KB信号通路相关的重要差异基因,RT-PCR验证结果显示TRAF3、CXCL12、 CXCR4、TNF-α、Bcl2a1、BCL-XL的表达量,NT组较OP组,分别高出80.00%、61.71%、72.81%、85.92%、87.19%、38.07%(P<0.05),而IL-1β的表达量,NT组较OP组降低69.62%(P<0.05)结论:(1)大鼠去势后,骨结构发生明显改变,骨小梁明显减少,松质骨数量降低,动物模型建立成功;(2)全骨髓贴壁法能成功分离、培养出大量纯度较高的BMSCs;(3)与NT组相比,OP组BMSCs成骨能力明显减弱;(4)NT组与OP组BMSCs在诱导成骨过程中存在着明显的基因表达差异,其中差异基因TNF-α、IL-1β、Bcl2al、BCL-XL、TRAF3、CXCL12、 CXCR4与NF-κB信号通路相关。
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