论文部分内容阅读
研究背景：寨卡病毒（ZIKV）最早于1947年在乌干达的恒河猴体内分离。1953年，人感染寨卡病毒首先于尼日利亚发现。迄今为止，全世界范围内已有超过60个国家报道了ZIKV感染病例。ZIKV可引起神经系统疾病，例如格林-巴利综合症和先天性寨卡综合症，症状包括小头畸形，脑部异常和其他先天性畸形等。该病毒由伊蚊传播，与黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒同属于黄病毒属。ZIKV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，含约11kb的基因组，具有三种结构蛋白：衣壳蛋白（capsid，C），膜蛋白（membrane，M）和包膜蛋白（envelope，E），其中E蛋白在感染和发病机制中起着重要作用。E蛋白是一种跨膜蛋白，由DI、DII和DIII三个结构域、一个融合环（FL）和一个茎环结构（S）组成。其中DI和DII结构域可以诱导与其他黄病毒（如登革热病毒和西尼罗河病毒）发生交叉反应的抗体，而DIII结构域却能诱导产生ZIKV特异性抗体。因此，DIII结构域是研制疫苗和治疗性抗体的重要靶点。目前正在开发的ZIKV候选疫苗包括灭活病毒、减毒活疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒（VLP）和各种亚单位疫苗等。这些疫苗仍处于临床试验阶段，没有一个获得最终批准。本课题组前期已设计制备了基于ZIKV的EDIII结构域与人IgG Fc段的融合蛋白亚单位疫苗，并验证其可在小鼠体内诱导特异性中和抗体。
研究目的：本研究旨在比较佐剂MF59、Alum、MPL和AS04（Alum+MPL）对ZIKA EDIII亚单位蛋白疫苗的辅佐效果，鉴定出能够诱导平衡的免疫应答和有效抵抗ZIKV感染的佐剂或佐剂组合，并进一步寻找EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位，优化亚单位疫苗的设计。
研究方法：（1）利用真核蛋白表达系统，表达ZIKV-M375N/E377T-Fc EDIII重组蛋白，经Protein A层析柱纯化，然后将该蛋白与不同佐剂混合，分别免疫小鼠，三周后加强免疫一次，并在最后一次免疫后第7天收集血清；通过ELISA法检测小鼠免疫血清中EDIII蛋白特异性IgG抗体滴度、E蛋白特异性IgG抗体滴度以及hFc的IgG抗体滴度；通过空斑减少中和实验测定免疫血清中针对三种寨卡病毒株R103451、PAN2016、PRVABC59的中和抗体；利用流式细胞术检测免疫小鼠中活化并分泌细胞因子的CD4+T和CD8+T细胞频率；在活病毒攻击试验中，分别用空斑实验和qPCR法检测免疫小鼠血清以及各组织中病毒的滴度和RNA拷贝数。（2）寻找寨卡病毒EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位。根据蛋白晶体结构及功能特点，选取7个在ZIKV EDIII上不同的独立表位，利用定点突变PCR法在相应位点形成N糖基化基序以封闭该表位，在293T细胞中表达并纯化这些突变蛋白；利用Western Blot鉴定糖基化的形成；通过ELISA法检测ZIKV突变蛋白的免疫反应性；通过免疫BALB/c和A129小鼠，检测突变蛋白诱导的特异性抗体、中和抗体、中和免疫原性、主动免疫保护作用和被动免疫保护效应。
研究结果：（1）通过小鼠免疫实验，分析不同佐剂对ZIKV EDIII蛋白疫苗功效的影响。ELISA结果显示：使用MPL+Alum佐剂组合能显著提高免疫血清中EDIII特异性抗体水平，且IgG1/IgG2a比率更低，诱导的IgG抗体反应更均衡；空斑中和实验显示：MPL+Alum佐剂组诱导的针对3种ZIKV病毒株的中和抗体滴度更高；流式细胞分析显示：相比于使用单一佐剂，MPL+Alum佐剂组可显著提高EDIII蛋白诱导的Th1、Th2、Th17以及IFN-γ+/CD8+T细胞和IL-4+/CD8+T细胞的频率；（2）MPL+Alum佐剂组能显著增强疫苗诱导的免疫保护作用，能保护小鼠抵御更高剂量ZIKV的攻击；（3）探讨EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位，初步检测了ZIKV EDIII蛋白的7个关键位点糖基化修饰对疫苗免疫保护作用的影响。蛋白抗原性分析显示：位于366位的糖基化突变蛋白可与所用5种中和性抗体结合，而不与非中和性单抗ZV-2结合；位于393位的糖基化突变完全阻断了EDIII蛋白与其中的3种中和抗体的结合；位于333位的糖基化突变也能完全阻断EDIII蛋白与其中3种中和抗体的结合；中和抗体分析显示：带有333或366糖基化位点的EDIII突变蛋白免疫小鼠能显著提高中和抗体滴度，带有309或393糖基化位点的EDIII突变蛋白则能够降低免疫小鼠内中和抗体滴度，其他带有315、351和369位点糖基化的EDIII突变蛋白所诱导的中和抗体滴度与野生型DEIII蛋白相比没有显著差异；（4）小鼠活病毒攻击实验显示：带有333或366糖基化位点的EDIII突变蛋白能够显著提高疫苗的主动免疫保护作用以及被动免疫保护作用，而带有309或393糖基化位点的EDIII突变蛋白则能有效降低疫苗的免疫保护作用。
结论：相比于单一佐剂的使用，Alum和MPL佐剂组合（AS04）能显著增强ZIKV EDIII亚单位疫苗的免疫原性和小鼠对寨卡病毒感染的免疫保护力，可作为ZIKV EDIII亚单位疫苗的有效佐剂。四个关键位点（333、366、393和309位）的糖基化能有效改变EDIII亚单位疫苗的免疫保护功效。通过糖基化修饰ZIKA EDIII亚单位的333或366关键位点可以成功封闭非中和性优势表位，提高疫苗诱导中和抗体的效能以及免疫原性和免疫保护性。
研究目的：本研究旨在比较佐剂MF59、Alum、MPL和AS04（Alum+MPL）对ZIKA EDIII亚单位蛋白疫苗的辅佐效果，鉴定出能够诱导平衡的免疫应答和有效抵抗ZIKV感染的佐剂或佐剂组合，并进一步寻找EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位，优化亚单位疫苗的设计。
研究方法：（1）利用真核蛋白表达系统，表达ZIKV-M375N/E377T-Fc EDIII重组蛋白，经Protein A层析柱纯化，然后将该蛋白与不同佐剂混合，分别免疫小鼠，三周后加强免疫一次，并在最后一次免疫后第7天收集血清；通过ELISA法检测小鼠免疫血清中EDIII蛋白特异性IgG抗体滴度、E蛋白特异性IgG抗体滴度以及hFc的IgG抗体滴度；通过空斑减少中和实验测定免疫血清中针对三种寨卡病毒株R103451、PAN2016、PRVABC59的中和抗体；利用流式细胞术检测免疫小鼠中活化并分泌细胞因子的CD4+T和CD8+T细胞频率；在活病毒攻击试验中，分别用空斑实验和qPCR法检测免疫小鼠血清以及各组织中病毒的滴度和RNA拷贝数。（2）寻找寨卡病毒EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位。根据蛋白晶体结构及功能特点，选取7个在ZIKV EDIII上不同的独立表位，利用定点突变PCR法在相应位点形成N糖基化基序以封闭该表位，在293T细胞中表达并纯化这些突变蛋白；利用Western Blot鉴定糖基化的形成；通过ELISA法检测ZIKV突变蛋白的免疫反应性；通过免疫BALB/c和A129小鼠，检测突变蛋白诱导的特异性抗体、中和抗体、中和免疫原性、主动免疫保护作用和被动免疫保护效应。
研究结果：（1）通过小鼠免疫实验，分析不同佐剂对ZIKV EDIII蛋白疫苗功效的影响。ELISA结果显示：使用MPL+Alum佐剂组合能显著提高免疫血清中EDIII特异性抗体水平，且IgG1/IgG2a比率更低，诱导的IgG抗体反应更均衡；空斑中和实验显示：MPL+Alum佐剂组诱导的针对3种ZIKV病毒株的中和抗体滴度更高；流式细胞分析显示：相比于使用单一佐剂，MPL+Alum佐剂组可显著提高EDIII蛋白诱导的Th1、Th2、Th17以及IFN-γ+/CD8+T细胞和IL-4+/CD8+T细胞的频率；（2）MPL+Alum佐剂组能显著增强疫苗诱导的免疫保护作用，能保护小鼠抵御更高剂量ZIKV的攻击；（3）探讨EDIII亚单位疫苗的非中和性优势表位，初步检测了ZIKV EDIII蛋白的7个关键位点糖基化修饰对疫苗免疫保护作用的影响。蛋白抗原性分析显示：位于366位的糖基化突变蛋白可与所用5种中和性抗体结合，而不与非中和性单抗ZV-2结合；位于393位的糖基化突变完全阻断了EDIII蛋白与其中的3种中和抗体的结合；位于333位的糖基化突变也能完全阻断EDIII蛋白与其中3种中和抗体的结合；中和抗体分析显示：带有333或366糖基化位点的EDIII突变蛋白免疫小鼠能显著提高中和抗体滴度，带有309或393糖基化位点的EDIII突变蛋白则能够降低免疫小鼠内中和抗体滴度，其他带有315、351和369位点糖基化的EDIII突变蛋白所诱导的中和抗体滴度与野生型DEIII蛋白相比没有显著差异；（4）小鼠活病毒攻击实验显示：带有333或366糖基化位点的EDIII突变蛋白能够显著提高疫苗的主动免疫保护作用以及被动免疫保护作用，而带有309或393糖基化位点的EDIII突变蛋白则能有效降低疫苗的免疫保护作用。
结论：相比于单一佐剂的使用，Alum和MPL佐剂组合（AS04）能显著增强ZIKV EDIII亚单位疫苗的免疫原性和小鼠对寨卡病毒感染的免疫保护力，可作为ZIKV EDIII亚单位疫苗的有效佐剂。四个关键位点（333、366、393和309位）的糖基化能有效改变EDIII亚单位疫苗的免疫保护功效。通过糖基化修饰ZIKA EDIII亚单位的333或366关键位点可以成功封闭非中和性优势表位，提高疫苗诱导中和抗体的效能以及免疫原性和免疫保护性。