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目的：溶瘤病毒作为一种特殊的肿瘤治疗药物或基因治疗载体显示出广阔的应用前景。然而，溶瘤病毒的免疫原性成为限制其广泛应用的瓶颈。为了保护溶瘤病毒免受机体免疫排斥，构建一种新型溶瘤病毒，使其可以利用对肿瘤具有识别和杀伤能力的CIK细胞作为运载工具。1.缺失病毒病毒复制必需基因E1B55-kD的同时利用hTERT启动子替换E1A启动子，保证病毒仅在肿瘤细胞中增殖，提高CIK细胞运载病毒的安全性；2.利用Ad35纤毛knob和shaft替换Ad5的knob和shaft，提高病毒对CIK细胞的感染能力；3.利用IL-2作为病毒携带的治疗基因，提高病毒的抗肿瘤能力。构建双调控嵌合型溶瘤病毒Ad5/F35-hTERT-ZD55-IL-2，利用细胞实验初步检测CIK细胞对其的运载能力。 方法：1.构建穿梭质粒pZD55-IL-2：以pcDNA3.1-IL-2质粒(实验室保存)为模板，设计引物，分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，PCR扩增得到IL-2的cDNA，SalⅠ和BamHⅠ双酶切并纯化PCR产物，克隆进质粒pPCA13(实验室保存)，构建质粒pPCA13-IL-2并测序；使用BglⅡ酶切质粒pPCA13-IL-2，电泳回收酶切产物，纯化获得含CMV启动子的CMV-IL-2基因片段，克隆进质粒pZD55(实验室保存)，构建pZD55-IL-2，酶切鉴定并测序。2.构建穿梭质粒phTERT-ZD55-IL-2：使用KpnⅠ和PvuⅠ双酶切质粒pZD55-IL-2和phTERT-ZD55(实验室保存)，电泳酶切产物并分别纯化回收pZD55-IL-2的小片段和phTERT-ZD55的大片段，连接获得质粒phTERT-ZD55-IL-2，酶切鉴定并测序。同时构建对照质粒phTERT-ZD55-EGFP，方法同上。3.新型溶瘤腺病毒的重组、包装和鉴定：利用穿梭质粒phTERT-ZD55、phTERT-ZD55-IL-2、phTERT-ZD55-EGFP，分别与嵌合型骨架质粒pBHG-fiber5/35通过Lipofectamine2000共转染293细胞，9-14天后出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取病毒DNA并应用PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒分别命名为Ad5/F35-hTERT-ZD55，Ad5/F35-hTERT-ZD55-IL-2和Ad5/F35-hTERT-ZD55-EGFP。4.体外检测CIK细胞对新型溶瘤病毒的运载能力：不同体外培养MOI：1、10、20、50和100的病毒Ad5/F35-hTERT-ZD55-EGFP感染CIK细胞，分别在感染后的6h、12h、24h和48h，观察嵌合型双调控腺病毒对CIK细胞的感染能力及感染后CIK细胞的存活时间。 结果：1.酶切鉴定和测序表明质粒pPCA13-IL-2、pZD55-IL-2构建成功。2.酶切鉴定和测序表明质粒phTERT-ZD55-IL-2、phTERT-ZD55-EGFP构建成功。3.PCR鉴定表明病毒Ad5/F35-hTERT-ZD55，Ad5/F35-hTERT-ZD55-IL-2，Ad5/F35-hTERT-ZD55-EGFP，包含目的基因，且无野生型腺病毒污染。4.MOI=10时病毒对CIK细胞的感染能力已达到30％(14/46)，且CIK细胞存活不受病毒的影响。 结论：成功构建的嵌合型双调控溶瘤腺病毒Ad5/F35-hTERT-ZD55-IL-2，能够被CIK细胞高效运载，且不影响CIK细胞的活性，为进一步研究CIK细胞联合溶瘤腺病毒抗肿瘤的动物实验及联合作用机制的探讨奠定了基础。