糖尿病是一种发病机制复杂的代谢性疾病,随着糖尿病病程的加长会并发眼部、肾脏等病变。其中眼科病变以糖尿病视网膜病变(DR)为典型代表,是造成失明的主要因素之一。研究表明,多元醇途径亢进与DR关系密切。大量临床研究显示复方血栓通胶囊对DR有显著的治疗效果,但其药效物质基础并不十分明确,导致其生产工艺无法精进,药典质量标准不够完善,阻碍了其在临床上的应用及在国际市场的拓展。因此,本文在课题组前期研究基础上,以醛糖还原酶(AR,多元醇通路的第一限速酶)为靶位酶,从有效成分层面出发,对复方血栓通胶囊主要有效成分及其配比进行AR活性抑制作用的研究,以期使其药效物质基础更明确,同时为其以后的发展方向提供一定的依据。本实验分为四部分：1建立了醛糖还原酶的提取、分离、纯化方法。取新鲜SD大鼠晶状体,以W：v(1：3)的比例加入pH6.2(AR的最佳酶活力条件为pH6.2)磷酸盐缓冲溶液,于<4℃条件下在研钵中研磨,4℃离心,取上清；加入饱和硫酸铵溶液,使其饱和度为40%,离心取上清,重复此步骤分别使硫酸铵饱和度为50%、75%对蛋白进行逐级纯化；最后用同一缓冲溶液溶解沉淀,置于冰箱中透析12h,透析液每4h更换一次。粗AR酶的蛋白含量采用经典考马斯亮蓝法进行测定。2建立了用紫外分光光度计法测定AR活性的方法。以还原性辅酶II(NADPH,于340nm处有特征吸收)为辅酶,DL-甘油醛为底物,AR催化DL-甘油醛还原成甘油,NADPH则转化为340nm无吸收的NADP+,因此,可根据吸光度的下降速率确定AR活性。本实验逐一对NADPH浓度、酶量、反应温度、DL-甘油醛浓度等酶促反应条件进行考察,对反应体系进行了优化。最终反应体系总体积为1mL,反应体系组成如下：AR粗酶(100μL)、0.0156mmol/LNADPH、100mmol/L pH62磷酸盐缓冲液、400Inmol/L硫酸锂、100mmol/L β-巯基乙醇、0.2Inmol/L DL-甘油醛,反应温度37℃。规定反应温度时使反应体系吸光度变化0.001为一个酶活性单位,即酶活力单位=AOD×1000,优化后AR活性为36个单位,活性良好。3采用上述醛糖还原酶活性测定方法,选取复方血栓通胶囊中含量较高的三七皂苷R1、人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、黄芪甲苷、哈巴俄苷10种原形成分；另选取文献报道的人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh2、人参皂苷F1、人参皂苷F2、原人参二醇、原人参三醇等7种三七总皂苷代谢成分,研究17种成分对醛糖还原酶活性的抑制作用,得R1、Rg1、Rb1、Rd、丹酚酸B、丹参酮I、隐丹参酮、黄芪甲苷、哈巴俄苷、F1、F2、Rg3、Rh1、Rh2、原人参二醇、原人参三醇的IC5o分别为：0.180、0.109、1.01、0.15、0.799、0.0652、0.0742、0.315、0.00385、0.720、0.582、0.202、0.547、0.494、0.260、0.189μmol/mL,Re无显著作用,阳性对照槲皮素IC50为0.205μmol/mL。4从17种成分中选取主要的8种原形成分：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、黄芪甲苷、哈巴俄苷,以八因素三水平对其进行正交实验设计,对不同配比的各成分组方进行AR活性抑制作用研究。结果表明：对抑制率影响具有统计学意义的为：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹参酮I哈巴俄苷(P<0.05),且影响的重要程度关系为：R1>Rgl>哈巴俄苷>丹参酮I；建立的多元线性回归方程为：y=-0.116+8.86R1+6.48Rg1+3.00丹参酮I+0.773哈巴俄苷,r2=0.912,P<0.01,方程可信；较优成分配比为：R1、Rg1、Rbl、丹参酮I、隐丹参酮、黄芪甲苷、哈巴俄苷=1.00：0.0925：3.33：2.22：0.0534：0.251：0.00753：0.599。本论文建立了实用性较强的醛糖还原酶提取分离纯化、蛋白含量测定、活性测定方法,并以复方血栓通胶囊中的主要有效成分及不同配比的成分组方进行了醛糖还原酶活性抑制作用研究,明确复方血栓通中有效成分的作用靶点,阐释复方血栓通胶囊治疗DR的药效物质基础及作用机制。研究成果不仅为复方血栓通的质量控制奠定基础而且使其更好地应用于临床。