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背景和目的毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)被选为种子细胞用于构建组织工程皮肤以修复临床烧伤、创伤、慢性溃疡等皮肤缺失已成为医学研究的热点。毛囊是皮肤的重要附属器官,从内向外依次由毛干、内根鞘和外根鞘组成。毛囊隆突部位于外根鞘近表皮端,皮脂腺下方竖毛肌附着处,此处的细胞体外培养时表现出干细胞的特性,即可自我复制、慢周期性和具有多向分化潜能。目前已经得到证实,隆突部的这一群特殊的细胞为毛囊干细胞。毛囊干细胞具有多向分化迁移能力,不仅能向上分化并迁移参与表皮更新和皮脂腺维持,而且能向下端毛球部分化并迁移参与形成毛囊。毛囊干细胞分化倾向的不同是由多种因素共同决定的,不仅有细胞内部分子及基因的调控,也有外来信号及微环境壁龛的协同作用,更有多条信号通路传导分化“命令”。在众多科研工作者的共同努力下发现,毛囊干细胞Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)在调控其增殖、分化中起到重要作用。Wnt/β-catenin信号通路在全身几乎所有的细胞中都存在,细胞受到刺激后释放Wnt蛋白,激活下游一系列大分子信号活性物质,最终导致基因表达改变,是诱导细胞分化和增殖的一条分子级联通路,在胚胎发育和肿瘤发生中,这条通路也起到关键性的作用。在HFSCs中,Wnt/β-catenin信号通路激活后会引起β-catenin在胞浆内的堆积,随之转入到细胞核中,与核内转录因子Tcf3/Lefl结合,激活下游靶基因c-myc、cyclin D1等的转录,促进毛囊干细胞定向分化。近年来有研究发现细胞外来干预因子氯化锂(LiCl)可抑制Wnt信号通路中β-catenin的降解,使之在细胞质中聚集,激活下游通路,影响毛囊干细胞分化的表型,但对于LiCl调节HFSCs分化的分子机制研究较少,且局限于在细胞质中作用的研究。本课题选用了氯化锂激活Wnt信号通路,探讨Wnt/β-catenin信号通路在人HFSCs向毛囊形成细胞或表皮细胞定向分化中的作用及与其他信号因子的相互关系,尤其是细胞核内的分子水平改变,以及药物控释系统的建立和在组织工程皮肤中的应用。方法1.头皮组织采用改进的毛囊隆突部获取方法及两步酶消化后,将带有隆突部的毛发剪成泥状,Ⅳ型胶原差速贴壁法获取毛囊干细胞。使用免疫荧光染色法对毛囊干细胞进行鉴定。以500个/孔(2.5×10~3/m1)、1000个/孔(5×10~3/m1)、2000个/孔(1×10~4/m1)、3000个/孔(1.5×10~4/m1)、5000个/孔(2.5×10~4/m1)接种于96孔培养板中,观察细胞生长情况,采用MTT法描绘其生长曲线,观察各密度培养的HFSCs在不同时间点的增殖效应,筛选出体外最佳的HFSCs传代培养密度。2.选用0、0.1、1、5、10、20、40、100mM/l的氯化锂诱导毛囊干细胞分化,观察毛囊干细胞的生存状态,确定氯化锂的毒性作用范围;选用0、5、10mM/l氯化锂作用于毛囊干细胞,MTT法对比分析各组对细胞增殖效应;LiCl终浓度分别为0、0.1、1、10、50、100、200、400μg/ml作用于毛囊干细胞,检测氯化锂的毒性,并探索促HFSCs分化的最佳LiCl浓度;采用real-time PCR技术定量检测0、5、10mmol/ml LiCl干预毛囊干细胞5d后Wnt信号通路中生物大分子:β-catenin、GSK-3β、Tcf3、c-myc和cyclin D1的mRNA水平,探讨LiCl诱导HFSCs分化过程中,LiCl的不同浓度对Wnt/β-catenin信号途径及其相关信号因子的表达的影响和相互作用。3.LiCl-PLGA纳米微球的制备:选用聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为微囊敷料,荷载适当浓度的氯化锂,采用复乳-溶剂挥发法制备载有氯化锂的纳米微囊。完全培养基培养人成纤维细胞,选用异体脱细胞真皮(ADM)为支架材料,以扩增培养的HFSCs为种子细胞接种于ADM表皮面,成纤维细胞接种于ADM真皮面,构建组织工程皮肤。采用5mM/l的LiCl干预构建的组织工程皮肤,培养5d后切片行HE染色、免疫荧光染色和免疫组织化学染色,观察种子细胞在ADM上的生长及分化情况,为动物实验奠定良好基础。结果1.从人头皮成功分离培养出HFSCs,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能,当HFSCs接种密度为1x10~4ml时,细胞增殖速度最快,扩展能力强,其生长曲线呈典型的S型。2.随LiCl浓度升高,细胞增殖效应减弱。含有LiCl的K-SFM条件培养基中HFSCs形态改变明显,各组间有明显差别,LiCl>10mmol/L时分化比例高。LiCl诱导毛囊干细胞Wnt信号通路的同时还有其一定的细胞毒性,浓度大于200μg/ml(约5mmol/L)时明显抑制细胞生长。实验研究发现在HFSCs分化过程中,LiCl可激活Wnt/β-catenin信号通路,当浓度为5mM/l时促使β-catenin及其拮抗物GSK3β、核内转录因子Tcf3、下游基因c-myc、cyclin D1的转录上调,浓度为10mM/l时除cyclin D1转录仍上调外,其余基因转录下调。3.扫描电镜观察细胞在PLGA-ADM材料上生长良好,分泌的胞外基质丰富,并随时间进展,细胞逐渐融合,细胞外基质分泌逐渐增多。HE染色观察发现HFSCs生长状态良好,单层排列分布于ADM表皮面上,LiCl干预组表皮面有毛囊样小凹形成,成纤维细胞与ADM真皮面贴附紧密,能分泌胞外基质形成连续细胞层包绕ADM。结论1.我们改进的培养方法能简便快捷的获取人HFSCs,且得到的人HFSCs在体外有较强的增殖及传代能力,1×10~4/ml接种密度是促进HFSCs增殖的最佳密度。2.LiCl促HFSCs分化明显,对HFSCs的干预有临界毒性浓度,当浓度大于200μg/ml时,细胞生长增殖受到明显抑制,同时这一浓度也是促HFSCs分化的最佳浓度。LiCl促HFSCs分化作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路、通路下游各因子转录上调相关,Tcf3在维持细胞未分化状态中发挥了一定的作用,cyclinD1的转录与氯化锂浓度作用呈正相关,在HFSCs的分化中起到重要作用。3.复乳-溶剂挥发法能快速高效的制备出载有LiCl的纳米微囊,其PLGA材料具有良好的细胞相容性,人HFSCs能在其上较好的粘附和生长。构建载有人HFSCs的组织工程皮肤,在LiCl诱导下能够促使种子细胞发生分子学改变形成毛囊样小凹,使构建带有皮肤附属器的组织工程替代物成为可能。