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低温冻害严重制约着一些商业类柑橘果树的种植和产量,而通过传统的育种方法难以获得耐低温冻害的柑橘品种。遗传改良可以弥补传统育种之不足,但前提是获得较好的低温抗性基因。枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf)属于芸香科枳属,为柑橘种植时常用的砧木。完全低温驯化后,枳可耐-26℃低温,但是其耐寒分子和生理机制的研究还不是很明晰。本研究利用4℃和25℃处理的枳叶片为材料,通过SSH技术筛选了一批低温应答相关基因。在此基础上,对筛选的β-淀粉酶基因PtrBAM1及枳中β-淀粉酶其它家族成员进行全长克隆,分析它们在不同胁迫及处理下的表达模式,并重点对PtrBAM1的抗寒功能进行了鉴定。主要结果如下：1.用4℃C和25℃处理3个月大的实生枳,取不同时间点(6h,1d,3d,5d,7d)的叶片提取RNA,将两个温度不同时间点的RNA分别混样分离mRNA,构建低温SSH正向和反向文库。两个文库差减效率较高,经反Northern blotting验证,挑选差异表达两倍以上的基因进行测序和分析。正反向库中各有188和180条序列成功测序,经CAP3拼接后正向库获得106条序列(75个单序列和31个contigs),反向库中获得121条序列(98个单序列和23个contigs)。利用Blast2Go对筛选基因的分子功能、生物学过程和细胞元件组分三方面进行注释分析。按分子功能分,正反库都可分为7大类,最大两类为催化和结合蛋白(正反库中催化蛋白各占43%和39%,结合蛋白各占35%和36%)；按生物学过程分,最大两类为代谢和外界刺激相关(代谢相关正反库中各占43%和45%,外界刺激各占9%和13%)；按细胞元件组分看,低温下生物膜结构和蛋白质复合体结构相关基因的表达都发生了改变。根据细胞膜保护、过量ROS清除、渗透平衡协调三个方面,我们从正反库中各挑选了6个ESTs进行半定量PCR验证,进一步验证它们确实为低温响应相关基因。另外,低温下枳叶片中总β-淀粉酶和GST的活性测定结果表明,它们活性的变化都与表达水平相符。2.在SSH文库筛选出一β-淀粉酶基因(BAM)片段的基础上,利用RACE克隆了其全长,命名为PtrBAMl,利用同源序列法依次获得该家族其它7个基因的全长,命名为PtrBAM2-8。通过序列比对和基因结构可将PtrBAMs分为4大类,Ⅰ类包括PtrBAM5;Ⅱ类包括PtrBAM1-3和PtrBAM8;Ⅲ类包括PtrBAM4;Ⅳ类包括PtrBAM6、7。根据序列比对和前人的研究,我们推测PtrBAM1可能在枳叶片淀粉降解中起决定性的作用,而PtrBAM6和PtrBAM7可能具有转录因子的特性。在低温、脱水、NaCl、麦芽糖等不同处理下,PtrBAM1-8之间的表达不尽相同,说明该基因家族个成员所行使的生理功能可能也会不同。3.淀粉染色实验和透射电镜观察结果显示PtrBAMl超表达烟草的三个转基因株系(F6、F11、F25)淀粉积累明显少于Nud野生型和1301空载系,而RNAi柠檬的两个系(bam1L1和L2)淀粉积累明显多于对照；同时,在正常情况下超表达烟草中β-淀粉酶活性、麦芽糖和可溶性糖含量都高于对照,说明PtrBAM1确实有水解淀粉的生理活性。-4℃冻害1h后常温恢复3d,超表达株系都可以恢复正常生长,而Nud和1301系绝大部分植株都枯萎死亡。在2℃低温处理下,超表达系的EL和MDA含量、O2-和H202积累都显著性低于对照。因为整个低温处理过程中超表达系的β-淀粉酶活性、麦芽糖和可溶性糖含量都高于对照(5d除外),说明PtrBAM1超表达可能通过增加糖类物质含量从而减少了质膜伤害及活性氧物质的积累,最终增强了植株的抗寒性。启动子克隆及分析和酵母单杂实验结果证明PtrBAM1受CBF调控。本工作从上游基因表达调控和下游代谢合成物质两个方面初步研究了PtrBAM1的抗寒功能。