论文部分内容阅读
目的: 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-2（insulin-like growth factorbinding protein-2，IGFBP-2）在神经干细胞(neural stem cells，NSCs)增殖和分化中的作用及机制。 方法: 1.嗅鞘细胞条件培养基(olfactory ensheathing cells-conditionedmedium，OCM)和星形胶质细胞条件培养基(astrocytes-conditionedmedium，ACM)中IGFBP-2表达情况分析:取新生1d昆明小鼠，分离培养嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）和星形胶质细胞(Astrocytes，ACs)，分别制备无血清OCM和ACM。凝胶电泳、蛋白质质谱分析及Western Blot检测OCM和ACM中IGFBP-2的含量，ELISA法测定IGFBP-2浓度。 2.IGFBP-2对NSCs增殖的影响:取第3代C17.2，根据IGFBP-2终浓度的不同分为0 ng/ml组、125 ng/ml组、250 ng/ml组、500 ng/ml组。作用5d后倒置显微镜下观察细胞生长情况并计数，流式细胞仪检测细胞周期变化并计算增殖指数，MTT检测细胞生长曲线。收集各组细胞行Western Blot检测细胞核增殖相关抗原(Ki67、PCNA)表达情况，检测总蛋白激酶1/2(total extracellular regulated proteinkinases，t-ERK1/2)及活化蛋白激酶1/2(positive extracellular regulated protein kinases，p-ERK1/2)表达情况; 3.IGFBP-2诱导NSCs分化:取第3代C17.2，根据培养基的不同，分为DMEM/F12培养基组和OCM培养基组，并根据IGFBP-2终浓度的不同分为0 ng/ml组，125 ng/ml组、250 ng/ml组、500 ng/ml组，诱导5d后收集各组细胞，行Western Blot检测细胞巢蛋白(Nestin)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)及β-微管蛋白Ⅲ（TUJ-1）表达情况，免疫荧光染色法鉴定GFAP，TUJ-1阳性细胞并计数，流式分析GFAP，TUJ-1阳性细胞。 结果: 1.OCM和ACM中IGFBP-2表达情况分析: Western Blot显不OCM中IGFBP-2蛋白表达比ACM中高。电泳及质谱分析结果示OCM中IGFBP-2的表达量约为ACM的2.3倍，ELISA检测结果显不OCM中IGFBP-2浓度为188±48.84 ng/ml，ACM中浓度为49.25±21.14 ng/ml; 2.IGFBP-2对NSCs增殖的影响:随着IGFBP-2浓度的递增，C17.2细胞数目及细胞活力明显增加，细胞周期检测示0 ng/ml组、125 ng/ml组、250 ng/ml组、500 ng/ml组S期细胞占比分别为(％):7.03±0.59、8.76±0.86、11.15±0.56、13.10±0.88，各组增殖指数PI分别为(％):17.62±2.12、19.98±2.04、21.71±1.76、25.48±1.01。Western Blot结果也证实，随着IGFBP-2浓度的增加，PCNA，Ki-67的表达随之提高;并且发现C17.2经IGFBP-2诱导5 min后，t-ERK1/2的表达无明显改变，p-ERK1/2表达迅速增加。 3.IGFBP-2诱导NSCs分化:D/F12培养基组:Western Blot、流式分析示各浓度组GFAP、TUJ-1表达差异无统计学意义;OCM培养基组:免疫荧光计数示0 ng/ml组、125 ng/ml组、250 ng/ml组、500 ng/ml组GFAP阳性细胞数目分别为(％):6.87±1.34、5.24±6.04、28.14±6.38、2.97±10.03;各组TUJ-1阳性细胞数目分别为(％):44.00±6.48、25.24±5.85、20.25±7.59、11.50±4.13。Western Blot也证实，随IGFBP-2浓度升高，GFAP表达逐渐增多，TUJ-1表达逐渐减少，各浓度组与对照组及各浓度组组间差异均有统计学意义。 结论: 1.IGFBP-2具有促进C17.2增殖的作用，此作用与IGFBP-2浓度呈正相关，其机制可能与ERK1/2通路激活有关; 2.IGFBP-2对C17.2分化无影响; 3.在OCM诱导条件下，IGFBP-2具有促进C17.2向胶质细胞分化，此作用与IGFBP-2浓度呈正相关。