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目的(1)应用分子生物学技术,从人正常肝细胞中扩增出hSOD1cDNA。(2)采用基因克隆技术,构建pGBKT7-hSOD1cDNA重组质粒;(3)通过对实验结果,进行双酶切凝胶电泳和测序验证,对测序报告结果中hSOD1基因序列进行序列与结构相关的生物信息学分析,为认识该基因结构与功能提供借鉴。方法(1)目的基因的提取:从人正常肝细胞中提取总RNA,然后对其进行反转录产生第一条cDNA链。根据GeneBank中人Cu/Zn-SODcDNA序列(序列号:AB087266)设计一对PCR引物,对反转录后产生的第一条cDNA链进行PCR扩增,获得目的基因。(2)穿梭质粒的构建与鉴定:①复苏本实验室保存的含穿梭质粒pGBKT7的DH5ɑ菌种,用质粒抽提试剂盒抽取质粒pGBKT7;②用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切质粒pGBKT7,获得线性化的pGBKT7片段,在T4DNA连接酶的作用下与目的基因连接,构建重组质粒pGBKT7-hSOD1cDNA;③对重组质粒pGBKT7-hSOD1cDNA进行酶切鉴定;④将重组质粒送测序公司进行DNA序列分析。(3)hSOD1cDNA基因的生物信息分析:根据测序报告结果中hSOD1基因序列,用生物信息学方法对其进行同源性、分子量等项的分析和预测。结果(1)利用分子生物学技术,成功扩增出目的hSOD1cDNA基因。(2)重组质粒pGBKT7-hSOD1cDNA经过EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后,进一步将重组体进行基因测序分析,验证了克隆的hSOD1cDNA序列与GeneBank中(AB087266)公布的hSOD1序列相符合。这一结果表明重组体pGBKT7-hSOD1cDNA中插入的目的基因是正向的、单倍插入。(3)hSOD1生物信息分析结果显示,hSOD1全长459bp,编码153个氨基酸,经过GeneBank查询发现与人SOD1基因序列有99%同源性。结论(1)成功构建了重组质粒pGBKT7-hSOD1cDNA,为深入研究hSOD1功能及与它相互作用蛋白的蛋白质网络奠定了物质基础;(2)分析hSOD1基因序列,有助于进一步了解该基因的分子和生物学功能。