电化学发光分析技术（Electrochemiluminescence,ECL）是在化学发光和电化学基础上发展起来的一种新的分析方法,它是通过电驱动促使某些物质发生电化学反应形成激发态并通过辐射光子返回基态,并对发光强度进行测量的一种分析方法。电化学发光分析技术兼具了化学发光和电化学技术的一些特点,比如灵敏度高、选择性好、背景信号低、线性范围宽,仪器设备简单、易操控。其中以鲁米诺为发光试剂的电化学发光传感器在生物分子的检测中表现出巨大的优越性,鲁米诺的电化学发光强度可以被过氧化氢（H₂O₂）强烈增敏,在生命体系中,多种代谢中间产物在相应氧化酶的催化下生成H₂O₂,据此建立起的基于酶-鲁米诺体系的电发光传感器可实现包括葡萄糖、乳酸、胆碱等在内的多种活性物质的灵敏检测。随着生命科学的快速发展,生物活性分子分析逐渐成为生物学家和分析家的的重要研究内容,成为揭开生命奥秘、监控生命体征、征服疾病的重要手段之一。因此,利用电化学发光开展对生物分子的定量分析已然成为研究的热点。但是,电化学生物传感器的蓬勃发展是近十年的时间,因此还具有巨大的上升空间。基于鲁米诺和酶构建的电化学发光生物传感器,其主要构建模式目前还比较简单,主要通过一些聚合膜对酶进行简单封装,电阻高,酶活性中心受阻,因而其灵敏度也有待进一步提高。同时,由于鲁米诺分子是加入到待测溶液中,也会对样品会产生一定的干扰和污染,对活体物质可能有毒害作用,操作也相对复杂,因此所构建的传感器在使用寿命、稳定性、长效性、灵敏度上均还有待提高。本研究即针对基于鲁米诺电致发光传感器的重要性及存在的问题,借助纳米科技的发展和应用,致力于改善和提高鲁米诺电发光传感器的性能,一方面开发高效的响应界面;另一方面以鲁米诺为前驱体合成鲁米诺功能化的电化学发光新材料,实现鲁米诺的固定化制备固相电化学发光电极,从而对生物活性分子可以快速、灵敏、无污染的检测。通过两方面的改进,为生物活性分子提供更有效的,充满前途的分析方法。其主要研究内容如下:（1）基于三维响应界面的葡萄糖电化学发光传感器构建及用于葡萄糖的超灵敏检测。葡萄糖是重要的生物活性分子,在近几年中,采用ECL法构建葡萄糖生物传感器取得了一定进展,但是在传统的葡萄糖ECL传感器的构建当中,葡萄糖氧化酶（GOD）主要通过nafion、壳聚糖等聚合膜封装,电阻高,酶活性中心被封闭,因此灵敏度并不高。本工作将导电聚合物引入到葡萄糖ECL传感器的构建当中,通过电聚合聚苯胺,在玻碳电极表面形成一层疏松、多孔的三维网状聚苯胺纳米线（PANi）,然后制备带负电荷的16nm的纳米金颗粒,并通过静电作用吸附到表面富含氨基的聚苯胺纳米线上,然后通过酶与纳米金之间的静电吸附及共价键合作用将GOD自组装到纳米金,最终构建成三维的GOD/Au NPs/PANi响应平台。由于该结构疏松多孔、导电性好、比表面积高,GOD负载量大,因此在以鲁米诺为发光试剂进行葡萄糖的ECL检测时,表现出超灵敏的响应,其线性范围为0.1-100μM,检测限0.05μM（S/N=3）。通过比较前人的工作,本实验所设计的电化学发光传感器具有更宽的线性范围和更低的检测限。在对血清样品中的葡萄糖进行检测时,也表现出良好的选择性、稳定性和灵敏度。（2）新型电化学发光材料鲁米诺还原纳米金/还原氧化石墨烯复合物的合成及用于细胞释放H₂O₂的检测。在传统的鲁米诺电化学发光传感器构建当中,鲁米诺作为发光试剂是加入到待测溶液中,模式虽然简单,但是鲁米诺会对样品、电极带来一定的污染和干扰,对活体待测物可能有毒害,同时也会增加操作步骤,增大误差。因此实现鲁米诺在电极上的固定,进行无试剂的检测,是该类传感器构建的重要发展目标。石墨烯具有众多非比寻常的物理、化学、光学性质,在本实验中,我们采用鲁米诺还原氯金酸的办法,在水热条件下制备出鲁米诺修饰的纳米金粒子,并在制备的过程中,以片状的还原氧化石墨烯为载体,一步合成出具有优秀电化学发光特性的鲁米诺还原纳米金/还原氧化石墨烯复合物（Lu-Au NPs/r GO）,用以制备性能优良的固相电化学发光传感器。过氧化氢（H₂O₂）是细胞中重要的生物活性小分子之一,对其进行活细胞的实时检测具有非常重要的意义。我们进一步利用合成的新材料、二甲基硅氧烷以及氧化铟锡玻璃构建出即可用于直接培养细胞,又能够进行原位检测细胞释放H₂O₂的电化学发光传感器,实现了对人肝癌细胞Hep G2所释放的H₂O₂的定量检测。由于细胞与电极响应界面的直接接触以及电化学发光自身的高灵敏响应特性,该传感器对细胞释放H₂O₂的检测取得良好效果,而且发光试剂的固定也避免了鲁米诺分子在溶液中对细胞的影响。（3）爆米花状聚鲁米诺包裹纳米金复合物的可控合成及用于尿酸的固相电化学发光检测。虽然鲁米诺分子固定化前人做了一定的工作,包括本人合成高效的Lu-Au NPs/r GO材料,但是这些材料在长效性和稳定性上还有待提高,因为从本质上这些方法均是鲁米诺分子在纳米材料上的吸附,鲁米诺分子有限导致在使用几次后信号发生衰减。因此寻找发光更持久、稳定的鲁米诺纳米材料非常具有吸引力,聚鲁米诺是有效的选择之一。在本实验中,我们采用水热法,通过调节鲁米诺与氯金酸的反应比例,合成出聚鲁米诺包裹纳米金的核壳结构纳米复合材料（Au@Polyluminol）,该复合物呈爆米花状,形状均一,分散度好,直径在200nm左右。由于聚鲁米诺聚合了大量的鲁米诺分子,因此比鲁米诺吸附的材料具有更稳定和持久的发光性能,而且由于纳米金增强电化学发光的作用,该材料对H₂O₂表现出高灵敏的ECL响应。我们将该材料与尿酸酶结合制备用于尿酸检测的固相电化学发光传感器,结果对尿酸检测表现出良好的线性范围、检测限、稳定性以及选择性。可以预见该复合物作为一种新的电化学发光材料在构建其他ECL传感器方面也将会发挥巨大作用。（4）红毛丹果状葡萄糖氧化酶/聚鲁米诺/纳米金复合物的合成及用于葡萄糖检测。在以聚鲁米诺包裹纳米金为电化学发光材料构建酶生物传感器的过程中,酶与材料之间的比例需要优化和调节,增加了传感器制备的过程,也加大了检测误差,如果能够制备出即含有活性酶,又具有电化学发光性能的双功能材料,那么将能够直接实现各种生物分子的检测,简化传感器制作步骤,增加检测的稳定性和重复性,具有非常大的应用价值。在本实验中,我们发现即使在常温下,只要有足够的时间,氯金酸也可缓慢氧化鲁米诺形成聚鲁米诺包裹的纳米金粒子。当加入适量的葡萄糖氧化酶后,不但没有阻止氧化的进行,反而在酶的调节下生成红毛丹果状、形状均一、分散度好、直径400nm左右的纳米绒球聚合物,经成分分析其组成为葡萄糖氧化酶/聚鲁米诺/纳米金（Au/PLUM/GOD）。由于在常温下合成,酶仍然保持其活性,基于该复合物构建的生物传感器后对葡萄糖表现出显著的电化学发光响应,并具有较好的灵敏度和很宽的线性范围,在葡萄糖检测上具有很大的利用价值。