食管癌是常见的恶性肿瘤之一,其致死率在恶性肿瘤中排名第六位。我国是食管癌的高发区,占世界发病总数的一半。近年来针对食管癌患者采用手术、放疗和(或)化疗等综合治疗,但食管癌患者平均生存期仍然低下。食管癌的这种不良预后与恶性肿瘤细胞的侵袭性以及这些非特异性疗法的毒副作用等密切相关,患者几乎术后都因残余肿瘤细胞复发或转移而死亡。因此,亟需寻找新的、有效的治疗方法来提高食管癌患者治疗效果,延长患者生存期。MiRNA的出现为解决这个难题提供了新的突破口。MiRNA通过调节细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等扮演着原癌基因或抑癌基因的角色。近年来,人们通过上调或者下调肿瘤中异常表达的mi RNA,取得了良好的治疗效果。研究表明:mi R-375在食管癌中显著下调,通过恢复mi R-375的表达能显著抑制食管癌细胞的增殖、侵袭、转移等。这表明mi R-375有望成为mi RNA基因治疗的候选分子,但是mi RNA本身易降解且带负电,在体内复杂的环境中很难到达肿瘤部位被肿瘤细胞吸收。因此,迫切需要开发一种安全、高效靶向递送系统将有治疗功能的基因/药物递送到靶细胞。作为天然的纳米载体,外泌体在药物递送方面日益显示出巨大的应用潜力。然而,如何获得大量、均一、稳定、多组分可控的外泌体是限制其进一步应用的瓶颈。本课题创新性的利用天然单细胞藻类-杜氏盐藻进行外泌体的规模化制备,借助外泌体在药物递送方面的天然优势,利用食管癌细胞对RGD多肽高亲和力的特性,构建高表达靶向食管癌细胞的外泌体,然后装载治疗性mi R-375和DOX,以实现靶向食管癌的药物共递送和联合治疗。通过进一步研究盐藻外泌体的偶联、RGD多肽的修饰及mi R-375/DOX的装载/释放,揭示其与食管癌细胞识别、相互作用及胞内输运的一般规律,解决其体外靶向性的问题;进一步在小鼠食管癌模型上考察盐藻外泌体靶向共递送能力和抑瘤机理。结果如下:透射电镜及纳米粒度仪表征显示,经超速离心提取的盐藻外泌体粒径主要分布在122±5 nm范围,形貌为外泌体典型“圆碟”形态;Zeta电位显示其表面电荷为-1.51±0.23 m V,进一步利用荧光共定位技术证实了RGD多肽与盐藻外泌体的成功偶联。接着使用电穿孔的方法将mi R-375质粒和化疗药物DOX加载到盐藻外泌体上;在电压300 V,电容为250μF时,质粒和DOX的加载率均为最佳:其中mi R-375质粒加载率为2.11±0.17%,DOX加载率为2.24±0.08%。并再次使用电镜与纳米粒度仪对加载后的工程化盐藻外泌体进行表征,结果表明多肽与质粒的成功加载略微增加了盐藻外泌体的尺寸,但是并没有破坏盐藻外泌体的形态。在细胞层面,用激光共聚焦显微镜观察到DIO荧光染料标记的修饰了RGD多肽的盐藻外泌体在食管癌细胞中富集,说明了成功修饰多肽的盐藻外泌体更容易被食管癌KYSE-150细胞摄取;MTT结果表明:工程化盐藻外泌体(RDExo/mi R-375/DOX)对食管癌KYSE-150细胞增殖率有着明显的抑制作用;细胞划痕实验及Transwell实验结果表明工程化外泌体递送系统显著抑制了细胞的迁移和侵袭;进一步的流式细胞检测结果表明:在R-DExo/mi R-375/DOX作用后,KYSE-150的细胞周期阻滞在G1期,导致G2期减少进而抑制细胞周期正常进行,细胞凋亡实验结果也说明工程化盐藻外泌体促进食管癌细胞的凋亡;最后,使用Western Blot对细胞周期蛋白E2(CCNE2)的表达水平进行分析,发现R-DExo/mi R-375/DOX实验组的CCNE2蛋白表达水平明显降低。接下来,我们建立了异位食管癌肿瘤动物模型来进一步研究工程化外泌体在体内的肿瘤靶向性和抑瘤效果,结果表明:RGD修饰的外泌体能有效地在肿瘤部位富集,说明工程化盐藻外泌体在体内具有良好的靶向性;肿瘤生长曲线、肿瘤重量及小鼠的生存曲线监测结果也进一步证实了R-DExo/mi R-375/DOX对肿瘤也有明显的抑制作用。同时,对小鼠多种器官的病理学分析表明该递送系统具有良好的生物相容性。综上所述,本研究成功通过化学偶联技术构建了基于盐藻外泌体的靶向药物递送系统,并在细胞和动物层面证明了该递送系统具有肿瘤特异靶向性和良好的生物相容性;初步的机理研究表明:mi R-375通过抑制细胞周期相关蛋白而实现与DOX协同增效的抑瘤效果。外泌体作为一种有效的药物递送工具,和其他已知的药物递送系统相比,它具有生物相容性好、无免疫排斥等优点。但是如何制备均一、稳定、组份可控且低生产成本的外泌体是制约其进一步应用的瓶颈。该研究为mi RNA药物递送提供了新的思路,并且通过工程化改造外泌体,可使其进行更有效更特异的靶向治疗。