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1.目的: 本研究拟从动物模型中,探讨积雪甙治疗炎症后成纤维细胞修复的作用机理,通过对光镜和电镜的观察了解在炎症发展过程中成纤维细胞显微结构和超微结构的改变,为积雪甙在临床广泛应用提供理论基础。 2.实验材料: 2.1 药物与试剂:积雪甙,上海现代浦东药厂有限公司生产,批号050401,规格6mg/片;四环素,成都景华制药厂生产,批号050302,规格0.25g/片;痤疮丙酸杆菌,由澳大利亚细菌实验室提供;10%甲醛溶液,由武汉大学医学院病理免疫室提供;2.5%戊二醛由武汉大学医学院电镜室提供。 2.2 实验动物:昆明纯系小鼠40只,雌雄各半,体重28±2g,鼠龄2个月,由华中科技大学同济医学院实验动物部提供。 2.3 仪器:光电双目显微镜1台,由武汉大学医学院免疫病理实验室提供;细胞计数器1个,由武汉大学医学院免疫病理实验室提供。LKB2V型超薄切片机,日立H2600型透射电镜由武汉大学医学院电镜实验室提供。 3.方法: 3.1 痤疮丙酸杆菌培养:冻干痤疮丙酸杆菌以脑心漫液溶解后,室温下放置数分钟,取少许溶液培养于5%血液琼脂,厌氧环境下35-37℃培养5-7天,用生理盐水洗涤3次,调整痤疮丙酸杆菌浓度为2×1010/ml备用。并经镜下检验确定为蓝色棒状杆菌。 3.2 造模:小鼠背部剪毛,约1×1厘米大小,每只小鼠三处,将已培养的痤疮丙酸杆菌生理盐水稀释两次后接种注射到小鼠的皮下,每一点注射2000万单位痤疮丙酸杆菌,注射后每日观察小鼠局部皮肤的变化。(《实验动物和动物实验技术》中国中医药出版社256) 3.3 分组:将40只实验小鼠随机分为四组,积雪甙+四环素组;积雪甙组;四环素组;空白对照组;每组10只。 3.4 灌胃:在造模后第7天,积雪甙+四环素组给予积雪甙混悬液0.25ml(0.144mg/ml)和四环素混悬液0.25ml(1.5mg/ml)灌胃。积雪甙组给予积雪甙混悬液0.25ml(0.144mg/ml)灌胃。四环素组给予四环素混悬液0.25ml(1.5mg/ml)灌胃。空白对照组给予生理盐水0.25ml灌胃。按规定剂量于每日上午8-10时给药。(《实验动物学》湖北科学技术出版社277常用实验动物及人的体表面积比例表) 3.5 光镜标本制作及观察:在造模后第3、7、10、14、21天切除小鼠皮肤,10%甲醛固定,按石蜡切片常规处理,用HE染色,在光镜下观察接种部位成纤维细胞造模后显微结构的改变,并在低倍镜下,用测微尺计数成纤维细胞总数。 3.6.电镜标本制作及观察:在造模后第3、7、14、21天切除小鼠皮肤,2.5%戊二醛前固定,1%锇酸固定,梯度乙醇脱水,树脂包埋,半薄切片定位,LKB2V型超薄切片机切片,日立H2600型透射电镜观察,观察接种部位成纤维细胞内细胞器结构的变化。 3.7 统计方法:治疗前后成纤维细胞的计数比较采用t检验。 4.结果: 局部接种注射后,第2天观察四组小鼠,可见接种部位皮肤明显肿胀,第3天光镜观察:表皮及真皮内炎细胞弥漫性浸润,以大量嗜中性白细胞为主,部分为单核细胞和淋巴细胞,组织水肿明显,肌间隙及肌层中炎细胞浸润。第7天时