沙门氏菌(Salmonella)是引发目前世界食源性疾病的主要病原菌。作为一种人畜共患的肠道致病微生物,沙门氏菌进化出了一套复杂的机制来逃避宿主免疫系统的攻击及增强自身在受感染细胞内生存的能力。早前关于沙门氏菌感染过程中与宿主相互作用的研究主要集中在其毒力岛(Salmonella pathogenicityislands 1 and 2,SPI-1 and SPI-2)Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion systems,T3SSs)编码与分泌的各种毒力因子上,其中毒力因子表达的调控尤为受到重视。近年来,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在免疫应答中的调控作用得到了广泛关注。在病原菌感染过程中,细菌来源ncRNA能够在细菌应对宿主体内环境压力的过程中,对自身毒力因子的表达进行调控,进而帮助细菌适应宿主体内的环境,完成其在宿主体内的生存与繁殖。目前,针对ncRNA在细菌-宿主相互作用过程中进行调控的探索仍处在初步阶段,本论文通过相关研究,揭示了一种全新的沙门氏菌来源的非编码RNA在感染过程中调控宿主免疫活动的机制。在研究沙门氏菌感染细胞的模型中,通过Solexa测序手段,在所感染的细胞内发现了沙门氏菌来源的小RNA片段,片段大小在19～24nt之间,与真核生物microRNA(miRNA)片段的大小相似,并且丰度接近细胞内源性miR-107。我们推测沙门氏菌感染过程产生了类miRNA的沙门氏菌来源的小RNA片段,它区别于细菌本身所编码的较长片段的ncRNA。为此,参照Solexa测序结果,我们挑选出其中丰度最高的5种小RNA为代表,运用qRT-PCR验证,结果表明这种小RNA片段仅能在细菌感染细胞后产生,体外培养条件下无法产生,表明小RNA片段的产生与细胞密切相关。在此基础上,我们挑选其中丰度最高的Sal-1进行深入探索,首先运用生物信息学手段分析这一小RNA片段的来源,序列分析结果显示其来源于沙门氏菌核糖体RNA 5’末端,且其可与邻近下游的序列形成类似于真核生物miRNA前体(pre-miRNA)的茎环结构。根据此结构,我们人工合成这段模拟前体的序列,并将此插入真核表达载体中,以此重组质粒转染细胞,转染后在细胞内同样检测出Sal-1片段,表明这种特殊茎环结构能够在细胞内剪切加工成类miRNA片段。参考miRNA成熟过程中的经典和非经典加工机制,我们运用RNAi技术确定参与Sal-1成熟过程的蛋白,研究表明,与真核生物经典miRNA的成熟过程不同,Sal-1由前体转变为成熟体的加工过程中,干扰宿主细胞内Dicer蛋白的表达并不影响Sal-1的产生,然而当Ago2蛋白下调后,Sal-1的产量显著下调,提示Sal-1的成熟与Ago2蛋白密切相关,然后我们分别在质粒转染细胞以及沙门氏菌感染细胞中进行进一步深入研究,结果提示Ago2参与了 Sal-1成熟的全过程。从前述结果可以得知,Sal-1是细胞内成熟的,在沙门氏菌将自身的RNA递送到宿主细胞的机制方面,本研究揭示了沙门氏菌感染宿主细胞的过程中会通过外膜囊泡(outer-membranevesicles,OMVs)包裹自身的非编码RNA分子并将其分泌至宿主细胞内。在功能方面,我们首先运用生物信息学软件预测Sal-1可能靶向的基因,根据Sal-1与靶基因结合的自由能,从预测结果中初步筛选出几种最有可能的靶基因。然后进一步运用qRT-PCR,Western Bot及细菌胞内存活率测定等实验,逐步缩小潜在靶基因的筛选范围。最终,我们从中筛选出Sal-1可以靶向宿主细胞内的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)并以真核生物miRNA的非经典调控方式对其进行调控,最终抑制宿主细胞内由iNOS介导的抗菌作用并促进沙门氏菌在细胞内的生存。体外与体内实验均表明,在降低感染细胞中Sal-1的表达量或在不影响蛋白功能的状态下对iNOS进行突变以使其无法被Sal-1靶向调控,均可以降低沙门氏菌对宿主防御的抵抗能力。综上所述,沙门氏菌在感染宿主细胞后,在宿主细胞内部可以检测到其来源的功能性小分子非编码RNA片段Sal-1,细菌通过这一小RNA片段对宿主免疫系统进行调控,产生有利于细菌在宿主细胞内生存的微环境。我们推测,这一细菌来源的有功能的非编码小分子RNA片段可能代表了一种全新的毒力因子或调控因子,将有助于揭示病原微生物感染的致病机理,以利于人类更好地控制病原微生物引起的种种疾患。